Was bedeutet der Ausdruck „Enzymaktivität“? Enzymatische Aktivität von Böden. Enzymatische Prozesse in Böden

Betrachten wir kurz die Faktoren, die die Geschwindigkeit der durch Enzyme katalysierten Reaktionen bestimmen, und Fragen zur Aktivierung und Hemmung von Enzymen.

Bekanntermaßen nimmt die Geschwindigkeit jeder chemischen Reaktion mit der Zeit ab, jedoch ist die Kurve der Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen im Verhältnis zur Zeit (siehe.

Reis. 4.17) hat normalerweise nicht die allgemeine Form, die für homogene chemische Reaktionen charakteristisch ist. Eine Abnahme der Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen im Laufe der Zeit kann auf die hemmende Wirkung von Reaktionsprodukten, eine Abnahme des Sättigungsgrads des Enzyms mit dem Substrat (da die Konzentration des Substrats mit fortschreitender Reaktion abnimmt) und teilweise zurückzuführen sein Inaktivierung des Enzyms bei einer bestimmten Temperatur und einem bestimmten pH-Wert der Umgebung. Darüber hinaus sollte der Einfluss der Geschwindigkeit der Rückreaktion berücksichtigt werden, der mit zunehmender Konzentration der Produkte der enzymatischen Reaktion erheblich sein kann. Unter Berücksichtigung dieser Umstände wird bei der Untersuchung der Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen in Geweben und biologischen Flüssigkeiten die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit normalerweise unter Bedingungen bestimmt, bei denen die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion nahezu linear ist (einschließlich wenn die Substratkonzentration hoch genug ist, um das Enzym zu sättigen). ).

Einfluss der Substrat- und Enzymkonzentrationen auf die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion

Aus dem obigen Material ergibt sich eine wichtige Schlussfolgerung, dass einer der wichtigsten Faktoren, die die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion bestimmen, die Konzentration des Substrats ist. Bei konstanter Enzymkonzentration steigt die Reaktionsgeschwindigkeit allmählich an und erreicht ein bestimmtes Maximum (siehe Abb. 4.12 und 4.13), wenn eine weitere Erhöhung der Substratmenge praktisch keinen Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit hat; In diesen Fällen wird allgemein davon ausgegangen, dass das Substrat im Überschuss vorliegt und das Enzym vollständig gesättigt ist. Der geschwindigkeitsbestimmende Faktor ist im letzteren Fall die Konzentration des Enzyms.

Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion hängt direkt von der Konzentration des Enzyms ab. In Abb. Abbildung 4.18 zeigt die Beziehung zwischen Reaktionsgeschwindigkeiten und zunehmenden Enzymmengen in Gegenwart sättigender Substratkonzentrationen. Die bestehende lineare Beziehung zwischen diesen Größen zeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zur Menge des vorhandenen Enzyms ist.

Aktivierung und Hemmung von Enzymen

Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion, also die Aktivität des Enzyms, wird auch durch die Anwesenheit von Aktivatoren und Inhibitoren im Medium bestimmt: Erstere erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit und verändern sie manchmal, letztere hemmen die Reaktion. Unter den chemischen Verbindungen, die die Aktivität von Enzymen beeinflussen, gibt es eine Vielzahl

Tabelle 4.4. Metallaktivierte Enzyme

Enzym	Metall	Enzym	Metall
Cytochrome	Fe	Amylase	Ca
Katalase	»	Lipase	»
Peroxidase	>>	Carboanhydrase	Zn
Tryptophanoxidase	»	Laktatdehydrogenase	»
Homogenisicase	»	Uricaza	»
Ascorbatoxidase	Si	Carboxypeptidase	»
Tyrosinase	»	Pyruvatcarboxylase	Mg
Phenoloxidase	»	Phosphatasen	»
Xanthinoxidase	Mo	Phosphoglucokinase	»
Nitratreduktase	»	Arginase	Mn
Aldehydoxidase	»	Phosphoglucomutase	»
Einige Peptidasen	Co	Cholinesterase	»

verschiedene Stoffe. So aktiviert Salzsäure die Wirkung von Pepsin, Gallensäuren – Pankreaslipase; Einige Gewebeenzyme (Oxidoreduktasen, Cathepsine, Arginase), pflanzliche Proteinase Papain und andere werden durch Verbindungen mit freien SH-Gruppen (Glutathion, Cystein) erheblich aktiviert, einige auch durch Vitamin C. Als Aktivatoren dienen besonders häufig zweiwertige Ionen und manchmal einwertige Metalle. Es gibt Hinweise darauf, dass etwa ein Viertel aller bekannten Enzyme die Anwesenheit von Metallen benötigen, um ihre volle katalytische Aktivität zu entfalten. Viele Enzyme sind in Abwesenheit von Metallen überhaupt nicht aktiv. Somit ist die Carboanhydrase bei der Entfernung von Zink praktisch frei von enzymatischer Aktivität; Darüber hinaus kann Zink für die Wirkung dieses Enzyms nicht durch ein anderes Metall ersetzt werden. Es sind Enzyme bekannt, deren Wirkung durch eine Reihe von Metallen aktiviert wird, insbesondere wird Enolase durch Mg 2+, Mn 2+, K+ aktiviert. In der Tabelle 4.4 liefert Beispiele für die Beteiligung von Metallen an der Wirkung einiger Enzyme.“

Bezüglich der Rolle von Metallen bei der aktivierenden Wirkung von Enzymen deuten die verfügbaren Daten darauf hin, dass Metallionen (Co 2 +, Mg 2 +, Zn 2 +, Fe 2+) in einigen Fällen die Funktionen prothetischer Enzymgruppen erfüllen oder als Elektron dienen Akzeptoren und Donoren oder wirken als Elektrophile oder Nukleophile und halten die reaktiven Gruppen in der erforderlichen Ausrichtung. In anderen Fällen tragen sie zur Anlagerung des Substrats an das aktive Zentrum und zur Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes bei. Beispielsweise sorgen Mg 2+-Ionen über eine negativ geladene Phosphatgruppe für die Anlagerung von Monophosphorsäureestern organischer Substanzen an das aktive Zentrum von Phosphatasen, die die Hydrolyse dieser Verbindungen katalysieren. In manchen Fällen verbindet sich das Metall mit dem Substrat und bildet so das eigentliche Substrat, auf das das Enzym einwirkt. Insbesondere Mg 2+ -Ionen aktivieren die Kreatinphosphokinase durch die Bildung eines echten Substrats – des Magnesiumsalzes von ATP. Schließlich gibt es experimentelle Hinweise auf die direkte Beteiligung von Metallen (z. B. Ca 2+ -Ionen im Speichelamylasemolekül) an der Bildung und Stabilisierung des aktiven Zentrums und der gesamten dreidimensionalen Struktur des Enzymmoleküls. Zu beachten ist auch, dass Metalle häufig als allosterische Modulatoren (Effektoren, siehe Abb. 4.22) wirken. Durch die Wechselwirkung mit dem allosterischen Zentrum fördert ein solches Metall (Effektor) die Bildung der günstigsten räumlichen Konfiguration des Enzyms und des aktiven Enzym-Substrat-Komplexes.

Anionen sind in physiologischen Konzentrationen normalerweise unwirksam oder haben nur eine geringe aktivierende Wirkung auf Enzyme. Die Ausnahme ist pe-

syn, einige durch Anionen aktivierte Oxidoreduktasen sowie Speichelamylase, die die Hydrolyse von Stärke katalysiert, deren Aktivität unter Einwirkung von Chlorionen zunimmt, und Adenylatcyclase, die durch Halogenanionen aktiviert wird.

Als Inhibitoren werden im Allgemeinen Substanzen bezeichnet, die eine teilweise oder vollständige Hemmung von durch Enzyme katalysierten Reaktionen bewirken. Kürzlich wurden Antienzyme (Antienzyme) entdeckt, bei denen es sich um Proteine ​​(oder Polypeptide) handelt, die als Enzyminhibitoren wirken. Zu diesen Substanzen gehören beispielsweise Soja-Trypsin-Inhibitor und Serum-Antitrypsin. Sie bilden Komplexe, die mit den entsprechenden Enzymen nur schwer zu dissoziieren sind. Manchmal kann ein Inhibitor Teil komplexer Enzyme sein, beispielsweise Proteinkinasen und Proteinphosphatasen, die die Prozesse der Phosphorylierung und Dephosphorylierung in lebenden Organismen katalysieren. Es ist jedoch noch nicht geklärt, ob solche Antienzyme echte Inhibitoren oder regulatorische Untereinheiten sind, insbesondere was der Unterschied im Zweck der regulatorischen (R) Untereinheit in der Proteinkinase und der inhibitorischen (I) Untereinheit in der Proteinphosphatase ist .

Enzyme sind Proteine, daher führen alle Mittel, die eine Proteindenaturierung verursachen (Hitze, Säuren, Laugen, Schwermetallsalze), zur Inaktivierung des Enzyms. Eine solche Inaktivierung ist jedoch relativ unspezifisch. Es hängt nicht mit dem Wirkungsmechanismus von Enzymen zusammen. Eine weitaus größere Gruppe bilden sogenannte spezifische Inhibitoren, die auf ein Enzym oder eine Gruppe verwandter Enzyme wirken. Die Erforschung dieser Inhibitoren ist aus mehreren Gründen wichtig. Erstens können Inhibitoren wertvolle Informationen über die Natur des aktiven Zentrums des Enzyms sowie über seine funktionellen Gruppen und chemischen Bindungen liefern, die die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes gewährleisten. Es sind Substanzen bekannt, die die eine oder andere Gruppe in einem Enzymmolekül spezifisch binden und es so aus dem Bereich einer chemischen Reaktion ausschließen. So gehen Jodacetat 1CH 2 -COOH, sein Amid und Ethylester, Parachlormercuribenzoat ClHg-CgH 4 -COOH und andere Reagenzien relativ leicht chemische Bindungen mit einigen SH-Gruppen von Enzymen ein. Wenn solche Gruppen für den Katalysevorgang essentiell sind, führt der Zusatz solcher Inhibitoren zu einem vollständigen Verlust der Enzymaktivität:

R- S H+ICH 2 -COOH-«-HI+R- S -CH2-COOH

Die Wirkung einer Reihe anderer Enzyme (Cholinesterase, Trypsin und Chymotrypsin) wird durch einige Organophosphorverbindungen, wie z. B. DPP, aufgrund der Blockierung der Schlüsselhydroxylgruppe von Serin im aktiven Zentrum stark gehemmt. Zweitens finden Inhibitoren in der Enzymologie breite Anwendung bei der Untersuchung der Natur mehrerer Formen von Enzymen und Isoenzymen, die sich weniger in der elektrophoretischen Mobilität als vielmehr in der Empfindlichkeit gegenüber demselben Inhibitor unterscheiden.

Mit Hilfe von Inhibitoren, die einzelne Stufen eines mehrstufigen Stoffwechselprozesses ausschalten, lässt sich der Ablauf chemischer Reaktionen und die Art der beteiligten Enzyme genau bestimmen. So wurde unter Verwendung von Jodacetat, Fluorid und anderen Inhibitoren der glykolytische Weg der Redoxumwandlung von Glucose in Milchsäure im Muskelgewebe entschlüsselt, der aus 11 Stufen besteht, an denen 11 Enzyme und 10 Zwischenmetaboliten beteiligt sind.

Der Wirkungsmechanismus vieler Toxine und Gifte auf den Körper ist mit der Hemmung von Enzymen verbunden. So ist bekannt, dass bei einer Blausäurevergiftung der Tod durch eine vollständige Hemmung der Atmungsenzyme (Cytochromoxidase), insbesondere der Gehirnzellen, eintritt. Die toxische Wirkung einiger Insektizide auf den menschlichen und tierischen Körper beruht auf der Hemmung der Aktivität von Cholinesterase, einem Enzym, das eine wichtige Rolle bei der Aktivität des Nervensystems spielt.

Eine rationale Chemotherapie – der gezielte Einsatz von Medikamenten in der Medizin – sollte auf einer genauen Kenntnis des Wirkmechanismus dieser Medikamente auf die Biosynthese von Enzymen, die Enzyme selbst oder deren Regulation im Körper basieren. Zur Behandlung bestimmter Krankheiten werden manchmal selektive Hemmstoffe eingesetzt. Daher wird ein Inhibitor von Trypsin, Chymotrypsin und Kallikrein – Trasylol – häufig zur Behandlung von akuter Pankreatitis eingesetzt. Die selektive Hemmwirkung einiger natürlicher und synthetischer Verbindungen (sogenannter Antimetaboliten) auf Enzyme dient als Grundlage für die Entwicklung wirksamer Methoden zur Synthese chemotherapeutischer Arzneimittel. Dieser Weg eröffnet vielfältige Möglichkeiten zur Regulierung der Enzymsynthese und der Stoffwechselrate.

Arten der Hemmung. Man unterscheidet zwischen reversibler und irreversibler Hemmung. Verursacht ein Inhibitormolekül dauerhafte Veränderungen oder Modifikationen der funktionellen Gruppen des Enzyms, spricht man von einer irreversiblen Hemmung. Häufiger kommt es jedoch zu einer reversiblen Hemmung, die anhand der Michaelis-Menten-Gleichung quantitativ untersucht werden kann. Die reversible Hemmung wiederum wird in kompetitive und nicht-kompetitive Hemmung unterteilt, je nachdem, ob es möglich ist, die Hemmung der enzymatischen Reaktion durch Erhöhung der Substratkonzentration zu überwinden oder nicht.

Eine kompetitive Hemmung kann durch Substanzen verursacht werden, deren Struktur dem Substrat ähnelt, sich jedoch geringfügig von der Struktur des echten Substrats unterscheidet. Ein klassisches Beispiel für diese Art der Hemmung ist die Hemmung der Succinatdehydrogenase (SDH) durch Malonsäure. Dieses Enzym katalysiert die Oxidation durch Dehydrierung von Bernsteinsäure (Succinat) zu Fumarsäure:

Wenn dem Medium Malonat (Inhibitor) zugesetzt wird, reagiert es aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit mit dem echten Substrat Succinat (das Vorhandensein von zwei gleichen ionisierten Carboxylgruppen) mit dem aktiven Zentrum unter Bildung eines Enzyminhibitors komplex, eine Wasserstoffübertragung vom Malonat findet jedoch nicht statt. Da die Strukturen von Substrat (Succinat) und Inhibitor (Malonat)

sind immer noch etwas anders, sie konkurrieren um die Bindung an das aktive Zentrum! und der Grad der Hemmung wird durch das Verhältnis der Konzentrationen von Malonat: und Succinat bestimmt und nicht durch die absolute Konzentration des Inhibitors. Diese Art der Hemmung wird manchmal als metabolische Antagonismushemmung bezeichnet (Abb. 4.19). Allgemein kann die Reaktion zwischen einem Inhibitor und einem Enzym durch die folgende Gleichung dargestellt werden:

Der resultierende Komplex, der als Enzym-Inhibitor-Komplex (EI) bezeichnet wird, zersetzt sich im Gegensatz zum Enzym-Substrat-Komplex (ES) nicht unter Bildung von Reaktionsprodukten. Die Dissoziationskonstante des EI-Komplexes oder Inhibitorkonstante (ATj) kann in Anlehnung an die Michaelis-Menten-Theorie als das Verhältnis der Konstanten der Rück- und Vorwärtsreaktion definiert werden:

d. h. die Hemmkonstante ist direkt proportional zum Produkt aus der Konzentration des Enzyms und des Inhibitors und umgekehrt proportional zur Konzentration des E1-Komplexes.

Die Methode der Konkurrenzhemmung hat in der medizinischen Praxis breite Anwendung gefunden. Es ist beispielsweise bekannt, dass Sulfonamid-Medikamente zur Behandlung bestimmter durch Bakterien verursachter Infektionskrankheiten eingesetzt werden. Es stellte sich heraus, dass diese Medikamente strukturell der Para-Aminobenzoesäure ähneln, die die Bakterienzelle zur Synthese von Folsäure verwendet, die ein wesentlicher Bestandteil bakterieller Enzyme ist. Aufgrund dieser strukturellen Ähnlichkeit blockiert Sulfonamid die Wirkung des Enzyms, indem es para-Aminobenzoesäure aus dem Komplex mit dem Enzym, das Folsäure synthetisiert, verdrängt, was zu einer Hemmung des Bakterienwachstums führt.

Einige Analoga von Vitamin B6 und Folsäure, insbesondere Desoxypyridoxin und Aminopterin (siehe Kapitel 5), wirken als kompetitive sogenannte Coenzym-Inhibitoren (oder Antivitamine) und hemmen viele biochemische Prozesse im Körper.

Nichtkompetitive Hemmung wird durch Substanzen verursacht, die den Substraten strukturell nicht ähnlich sind und häufig nicht an das aktive Zentrum, sondern an eine andere Stelle im Enzymmolekül binden. Der Grad der Hemmung wird in vielen Fällen durch die Wirkungsdauer des Inhibitors auf das Enzym bestimmt. Bei dieser Art der Hemmung kommt es aufgrund der Bildung einer stabilen kovalenten Bindung häufig zu einer vollständigen Inaktivierung des Enzyms, anschließend wird die Hemmung irreversibel. Beispiele für eine irreversible Hemmung (Inaktivierung) sind die Wirkung von Jodacetat, DPP sowie Diethyl-p-nitrophenylphosphat und Blausäure, die in der Bindung und Abschaltung funktioneller Gruppen oder Metallionen im Enzymmolekül besteht.

Um die Frage nach der Art der Hemmung zu klären, nutzen Sie die Michaelis-Menten-, Lineweaver-Burk-Gleichungen oder andere, beispielsweise die Edie-Hofstee-Gleichung:

und entsprechende Diagramme in geradlinigen Koordinaten.

In Abb. 4.20 Es ist klar, dass bei einer kompetitiven Art der Hemmung der Inhibitor den Wert erhöht K t(um einen Betrag, der der Längendifferenz der auf der Abszisse abgeschnittenen Segmente entspricht), ohne dass dies Auswirkungen auf die Höchstgeschwindigkeit hat. Dies bedeutet, dass bei einer ausreichend hohen Substratkonzentration [S] der Inhibitor durch Substratmoleküle aus dem EI-Komplex verdrängt wird. Bei der nichtkompetitiven Hemmung (Abb. 4.21) reduziert der Hemmer die Maximalgeschwindigkeit. Wenn der Wert K t nicht abnimmt, dann spricht man von einer völlig wettbewerbsfreien Hemmung. Eine ähnliche Art der Hemmung tritt bei der Bildung inaktiver, schwer zu dissoziierender EI- und (oder) EIS-Komplexe auf. Häufig gibt es jedoch einen gemischten Typ der Hemmung (manchmal auch als teilweise nichtkompetitiver Typ bezeichnet), bei dem eine Verringerung von F max mit einer gleichzeitigen Erhöhung einhergeht K t. Dies bedeutet, dass der EI-Komplex eine Teilaktivität behält, d. h. die Fähigkeit, einen intermediären ternären Komplex EIS zu bilden, in dem das Substrat eine verzögerte katalytische Umwandlung durchläuft. In seltenen Fällen kann der Grad der Hemmung der Enzymaktivität mit zunehmender Substratkonzentration zunehmen; Für diese Art der Hemmung wurde der eher ungenaue Begriff nichtkompetitive Hemmung vorgeschlagen. Einer der Mechanismen einer solchen Hemmung beruht auf der Möglichkeit, den Inhibitor mit dem ES-Komplex zu kombinieren, um einen inaktiven oder langsam reagierenden ternären ESI-Komplex zu bilden.

Somit können durch die grafische Analyse der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeiten als Funktion der Substratkonzentrationen wertvolle Informationen über die Kinetik enzymatischer Reaktionen gewonnen werden, die den möglichen Mechanismus der enzymatischen Katalyse beleuchten.

REGULIERUNG DER ENZYMAKTIVITÄT

Eine der einzigartigen Eigenschaften lebender Organismen ist das erstaunliche Gleichgewicht von katabolen (biologisch abbaubaren) und anabolen (biosynthetischen) Prozessen. Gleichzeitig finden in Zellen gleichzeitig Prozesse der Synthese, Zersetzung und Umwandlung von Hunderten und Tausenden verschiedener Substanzen statt, die durch eine Vielzahl von Regulierungsmechanismen reguliert werden, die die Konstanz der inneren Umgebung des Körpers gewährleisten. Einige dieser Regulierungsmechanismen, unter denen Mechanismen zur Regulierung der Enzymaktivität eine wichtige Rolle spielen, werden im Folgenden diskutiert.

_£Einfluss Gesetz der Massenwirkung. Bei einer enzymkatalysierten reversiblen chemischen Reaktion, zum Beispiel: A + B<=* С + D концентрация компонентов реакции и со­ответственно направление реакции будут регулироваться влиянием закона действия масс. Оно, в частности, может быть показано в обратимой реакции трансаминиро-вания, катализируемой ферментом аланинаминотрансферазой:

Alanya + a-Ketoglutarat +± Pyruvat + Glutamat

Diese Art der Regulierung spielt offensichtlich nur eine begrenzte Rolle, da die Reaktion unter realen Bedingungen meist in eine Richtung verläuft, da die resultierenden Produkte als Substrate für die Wirkung anderer Enzyme dienen und aus der Reaktionssphäre entfernt werden können; In diesen Fällen stellt sich eher ein stabiler (stationärer) Zustand als ein echtes Gleichgewicht ein.

^Änderung der Menge Enzym. Das Phänomen der induzierten Enzymsynthese wurde bei Bakterien gut untersucht, wenn sie in einem Medium gezüchtet werden, in dem die einzige Kohlenstoff- und Energiequelle das eine oder andere Kohlenhydrat, beispielsweise Glukose, ist. Der Ersatz von Glucose im Medium durch Lactose führt zur induzierten oder adaptiven (nach einer kurzen Verzögerungsphase) Synthese des Enzyms Galactosidase (programmiert durch das Lactose-Gen, siehe Kapitel 13), das Lactose in Glucose und Galactose spaltet. In tierischen Geweben wird eine derart schnelle Synthese von Enzymen vergleichsweise seltener beobachtet, und der Mechanismus, der die Synthese induziert, wurde nur für eine kleine Anzahl von Enzymen untersucht (Tyrosin-Transaminasen, Serin- und Threonin-Dehydratasen, Tryptophan-Pyrrolase usw.). Wenn jedoch bestimmte Gifte, krebserregende Stoffe, Alkaloide und Insektizide in den Körper gelangen, kommt es nach einigen Tagen zu einem starken Anstieg der Aktivität (bzw. der Menge) von Enzymen – Hydroxylasen des endoplasmatischen Retikulums von Leberzellen, die Fremdstoffe oxidieren Substanzen in Produkte umwandeln, die für den Körper ungiftig sind. Andererseits wurden Fälle beschrieben, in denen unter der Wirkung solcher Hydroxylasen Fremdstoffe im Körper in toxischere Verbindungen umgewandelt werden. Dieses Phänomen, das das Gegenteil der Entgiftung ist, wird tödliche Synthese genannt.

"-■ Proenzyme. Proteolytische Enzyme des Magen-Darm-Trakts und der Bauchspeicheldrüse werden in inaktiver Form in Form von Proenzymen (Zymogenen) synthetisiert. Die Regulierung beruht in diesen Fällen auf der Umwandlung von Proenzymen in aktive Enzyme unter dem Einfluss spezifischer Wirkstoffe. Somit wird Trypsin in der Bauchspeicheldrüse in Form von Trypsinogen synthetisiert. Letzteres wird im Darm durch Autokatalyse oder unter Einwirkung anderer Proteinasen in aktives Trypsin umgewandelt (siehe Kapitel 11). Die Umwandlung von inaktivem Pepsinogen in aktives Pepsin erfolgt autokatalytisch durch begrenzte Proteolyse in Gegenwart von Salzsäure und ist außerdem mit der Abspaltung eines spezifischen Inhibitors polypeptidischer Natur vom Proenzym verbunden. Die Synthese von Proteinasen in inaktiver Form und einer Reihe anderer inaktiver Vorläuferproteine ​​​​hat offensichtlich eine gewisse biologische Bedeutung und verhindert die Zerstörung von Organzellen, in denen Proenzyme gebildet werden.

Chemische Modifikation des Enzyms. Einige Proteine ​​unterliegen während der Bildung ihrer Tertiärstruktur einer postsynthetischen Modifikation (siehe Kapitel 1). Es stellte sich heraus,

dass die Schlüsselenzyme des Energiestoffwechsels – Phosphorylase, Glykogensynthase usw. – auch durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung gesteuert werden, die durch spezifische Enzyme – Proteinkinase und Proteinphosphatase – durchgeführt werden, deren Aktivitätsniveau wiederum durch Hormone reguliert wird. Das Aktivitätsniveau der Schlüsselenzyme des Kohlenhydratstoffwechsels und dementsprechend die Intensität und Richtung der Stoffwechselprozesse selbst werden durch das Verhältnis der phosphorylierten und dephosphorylierten Formen dieser Enzyme bestimmt. Die chemische postsynthetische Modifikation von Enzymen umfasst auch Prozesse der begrenzten Proteolyse, Methylierung, Glykosylierung und anderer, wodurch eine mikroskopische Art der Regulierung der Enzymaktivität und dementsprechend der physiologischen Geschwindigkeit von Stoffwechselprozessen bereitgestellt wird.

Regulierung der Enzymaktivität nach dem Feedback-Prinzip. Bei vielen rein biosynthetischen Reaktionen ist die Rückkopplungshemmung die Hauptart der Geschwindigkeitsregulierung eines mehrstufigen enzymatischen Prozesses, wenn das Endprodukt der Biosynthesekette die Aktivität des Enzyms unterdrückt, das den ersten Schritt katalysiert.

Nehmen wir an, dass in Zellen ein mehrstufiger Biosyntheseprozess abläuft, von dem jeder Schritt durch ein eigenes Enzym katalysiert wird:

Die Geschwindigkeit einer solchen Gesamtreaktionsfolge wird maßgeblich von der Konzentration des Endprodukts (P) bestimmt, dessen Anreicherung über das zulässige Maß hinaus eine starke Hemmwirkung auf die erste Stufe des Prozesses bzw. auf das Enzym hat Et.

Zum ersten Mal wurde die Existenz eines solchen Mechanismus zur Steuerung der Enzymaktivität durch Metaboliten in E. coli nachgewiesen, als die Synthese von Isoleucin und CTP untersucht wurde. Es stellte sich heraus, dass Isoleucin, das Endprodukt, selektiv die Aktivität der Threonin-Dehydratase unterdrückt, die den ersten Schritt im Prozess der Umwandlung von Threonin in Isoleucin katalysiert, der fünf enzymatische Reaktionen umfasst. Ebenso hat CTP als Endprodukt des Biosynthesewegs eine hemmende Wirkung auf das erste Enzym (Aspartat-Carbamoyltransferase) und reguliert dadurch dessen eigene Synthese. Diese Art der Hemmung wird Feedback-Hemmung oder Retroinhibition genannt. Seine Existenz wurde in allen lebenden Organismen nachgewiesen und gilt derzeit als eine der führenden Arten der Regulierung der Enzymaktivität und des Zellstoffwechsels im Allgemeinen.“

Andererseits wurde bei amphibolischen Prozessen, die gleichzeitig biosynthetische und biologisch abbauende Funktionen erfüllen 2, die Existenz einer Regulation sowohl durch die Art der Retroinhibition als auch durch hochenergetische Verbindungen – Indikatoren für den Energiezustand der Zelle – nachgewiesen. Für amphibolische Prozesse ist eine einzigartige Art der Regulation, die nur ihnen eigen ist, außerdem die Aktivierung durch einen Vorläufer, wenn der erste Metabolit in einem mehrstufigen Stoffwechselweg das Enzym aktiviert, das die letzte Stufe katalysiert. Damit ist die aktivierende Wirkung von Glucose-6-phosphat, einem Vorläufer von Glykogen, auf das Enzym Glykogensynthase nachgewiesen.

Ähnliche Arten der Hemmung durch das Endprodukt und der Aktivierung durch das erste Produkt sind charakteristisch für allosterische (regulatorische) Enzyme, wenn der Effektor, der sich strukturell vom Substrat unterscheidet, in einem speziellen (allosterischen) Zentrum des Enzymmoleküls bindet, das räumlich vom Substrat entfernt ist aktives Zentrum. Die gegenseitigen Umwandlungen aktiver und inaktiver allosterischer Enzyme in vereinfachter Form sowie Konformationsänderungen, die bei der Anlagerung des Substrats und der Effektoren beobachtet werden, sind in Abb. dargestellt. 4.22. Die Anlagerung eines negativen Effektors an ein allosterisches Zentrum führt zu erheblichen Veränderungen in der Konfiguration des aktiven Zentrums des Enzymmoleküls, wodurch das Enzym die Affinität zu seinem Substrat verliert (Bildung eines inaktiven Komplexes).

Allosterische Wechselwirkungen manifestieren sich in der Art der Kurven der Abhängigkeit der anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeit von der Konzentration des Substrats oder Effektors, insbesondere in der S-Form dieser Kurven (Abweichung von der hyperbolischen Michaelis-Menten-Kurve). Dies bedeutet, dass die Bindung eines Substratmoleküls die Bindung eines zweiten Moleküls an das aktive Zentrum erleichtert und dadurch die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht. Darüber hinaus zeichnen sich allosterische regulatorische Enzyme durch eine nichtlineare Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Enzymkonzentration aus.

Andere Arten der Regulierung der Enzymaktivität. Es gibt eine Reihe weiterer Mechanismen, die die Geschwindigkeit von Stoffwechselprozessen und die Aktivität intrazellulärer Enzyme steuern. Die absolute Menge des in der Zelle vorhandenen Enzyms wird durch die Geschwindigkeit seiner Synthese und seines Abbaus reguliert. Zu den Regulierungsmechanismen können auch die Konkurrenz zwischen Enzymen um ein gemeinsames Substrat, die Abschaltung der Aktivität eines der Isoenzyme (in mehreren Formen von Enzymen), der Einfluss von Cofaktorkonzentrationen und das Phänomen der Kompartimentierung gehören. Der Kompartimentierungsmechanismus spielt offenbar eine wichtige biologische Rolle, indem er Enzyme mithilfe von Biomembranen räumlich von ihren Substraten trennt (z. B. lysosomale Enzyme: Proteinasen, Phosphatasen, Ribonukleasen und andere hydrolytische Enzyme von den zytoplasmatischen Substanzen, auf die sie einwirken). Darüber hinaus ermöglicht dieser Mechanismus die Trennung gleichzeitig inkompatibler Stoffwechselprozesse. Ein Beispiel für Letzteres könnten die Wege zur Synthese von Fettsäuren sein, die hauptsächlich in der löslichen Fraktion des Zytoplasmas vorkommen, und die Wege zum Abbau von Fettsäuren, die in den Mitochondrien konzentriert sind.

BESTIMMUNG DER ENZYMAKTIVITÄT

Die Bestimmung des quantitativen Gehalts an Enzymen in biologischen Objekten bereitet gewisse Schwierigkeiten, da Enzyme in Geweben bis auf wenige Ausnahmen in vernachlässigbar geringen Konzentrationen vorhanden sind. Daher wird die Menge an Enzymen anhand der Geschwindigkeit der katalysierten Reaktion unter bestimmten, vereinbarten Messbedingungen beurteilt. Unter optimalen Temperaturbedingungen, pH-Wert des Mediums und vollständiger Sättigung des Enzyms mit dem Substrat ist die Geschwindigkeit der katalysierten Reaktion proportional zu

Enzymkonzentration. Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion wird entweder anhand der Verlustrate des Substrats oder anhand der Bildungsrate des Reaktionsprodukts beurteilt. Um die Konzentration eines Enzyms auszudrücken und seine Aktivität zu quantifizieren, hat die Enzymkommission der International Biochemical Union eine internationale Standardeinheit (E oder U) empfohlen: ! Die Aktivitätseinheit eines Enzyms ist die Enzymmenge, die unter optimalen Bedingungen die Umwandlung von 1 Mikromol Substrat pro Minute (µmol/min) katalysiert. Im Zusammenhang mit der Einführung des Internationalen Einheitensystems (SI) wurde eine neue Definition der Enzymeinheit Catal (Kat) vorgeschlagen; 1 katalytische Aktivität ist in der Lage, eine Reaktion mit einer Geschwindigkeit von 1 Mol in 1 s (1 mol/s) durchzuführen. Das Verhältnis der internationalen Einheit (E) zu Catal kann wie folgt ausgedrückt werden: 1 Cat = 1 Mol -Mit"" = 60 mol x x min " = 60 10 6 µmol x x min " 1 = 6 10 7 E; oder 1 E = = 1 µmol min ~" =

= (1/60) µmol s " = = (1/60) µkat = 16,67 nkat. Somit entspricht 1 E Enzym 16,67 nkat._23

Es wird außerdem empfohlen, Enzymeinheiten bei 25 °C, dem optimalen pH-Wert und einer Substratkonzentration oberhalb der Sättigungskonzentration zu messen. In diesen Fällen entspricht die Geschwindigkeit einer Reaktion nullter Ordnung in Bezug auf das Substrat und hängt nur von der Enzymkonzentration ab.

Um die Aktivität in der praktischen Arbeit mit Enzymen auszudrücken, werden häufig die abgeleiteten Konzepte der spezifischen und molaren Aktivität verwendet. Die spezifische Aktivität eines Enzyms wird normalerweise als Anzahl der Einheiten enzymatischer Aktivität pro 1 mg Protein (oder als Anzahl der Katale pro 1 kg aktives Protein) ausgedrückt. Die Anzahl der Substratmoleküle, die von einem Enzymmolekül pro Sekunde umgewandelt werden, wird üblicherweise als Anzahl der Umdrehungen oder molare Aktivität bezeichnet (die molare katalytische Aktivität wird in Katalysatoren pro 1 g-Mol Enzym ausgedrückt). Ein Molekül Erythrozytenkatalase ist beispielsweise in der Lage, 1 von 44.000 Molekülen Wasserstoffperoxid 1 abzubauen.

INTRAZELLULÄRE LOKALISIERUNG VON ENZYMEN

Die Frage der Lokalisierung von Enzymen in den Strukturformationen der Zelle (Kern, Mitochondrien, Lysosomen etc.) ist insbesondere in der präparativen Enzymologie äußerst wichtig, wenn der Forscher die Aufgabe hat, das Enzym in seiner reinen Form zu isolieren und zu isolieren. Mithilfe der Zyto- und Histochemie lässt sich die Lokalisierung des Enzyms relativ einfach nachweisen. Dazu werden dünne Abschnitte des Organs mit geeigneten Substraten inkubiert und nach der Inkubation wird die Lokalisierung des Reaktionsprodukts durch Zugabe geeigneter Reagenzien zur Entwicklung einer spezifischen Farbe aufgedeckt.

In der präparativen Enzymologie wird häufiger die Methode der Differentialzentrifugation von Gewebehomogenaten verwendet. Dazu wird zunächst die Zellstruktur mit einem geeigneten Desintegrator zerstört und die resultierende quasihomogene (homogenisierte) Masse einer Differenzzentrifugation bei einer Temperatur von 0 - 4 °C unterzogen. Ein ungefähres Diagramm der Differentialzentrifugation von Homogenaten in Hochgeschwindigkeitszentrifugen ist in Abb. dargestellt. 4.23 „Üblicherweise wird die Verteilung von Enzymen in aufeinanderfolgenden Einzelfraktionen untersucht, die durch fraktionierte Zentrifugation von Homogenaten isoliert werden, insbesondere in der Kernfraktion, die bei niedriger Zentrifugationsgeschwindigkeit gewonnen wird, in der Mitochondrienfraktion, die bei mittlerer Zentrifugationsgeschwindigkeit sedimentiert wird , in der Mikrosomen- (oder Ribosomen-)Fraktion, deren Isolierung eine Hoerfordert, und schließlich im verbleibenden klaren Überstand, der die lösliche Fraktion des Zytoplasmas ist. Es ist zu beachten, dass die Mitochondrienfraktion nicht homogen ist, da Partikel vorhanden sind Daraus können sogenannte Lysosomen isoliert werden, die eine Zwischenstellung zwischen den Größen von Mitochondrien und Mikrosomen einnehmen. Auch die mikrosomale Fraktion ist heterogen, da sie hauptsächlich aus Elementen des endoplasmatischen Retikulums mit heterogener Struktur stammt.

Mithilfe der Zwurde gezeigt, dass die Kernfraktion von Leber und Nieren eine geringe Anzahl von Enzymen enthält, obwohl bekannt ist, dass einige Proteine ​​​​in den Kernen synthetisiert werden. Der Hauptort der Proteinsynthese ist, wie inzwischen festgestellt wurde, die Ribosomenfraktion des Zytoplasmas. Es wurde auch gezeigt, dass glykolytische Enzyme überwiegend in der löslichen Fraktion des Zytoplasmas konzentriert sind, während Cytochromoxidase und Enzyme des Krebszyklus in der mitochondrialen Fraktion lokalisiert sind. Enzyme, die die oxidative Phosphorylierung und den Abbau von Fettsäuren katalysieren, sind ebenfalls mit Mitochondrien verbunden. Enzyme, die die Biosynthese von Fettsäuren katalysieren, sind dagegen im löslichen Anteil des Zytoplasmas enthalten.

Um Enzyme aus biologischen Objekten in reinem (homogenen) Zustand zu isolieren und zu isolieren, wird das gesamte Arsenal an Methoden zur Isolierung von Proteinen in individueller Form eingesetzt, das oben ausführlich besprochen wurde (siehe Kapitel 1).

KLASSIFIZIERUNG UND NOMENKLATUR VON ENZYMEN

Die moderne Klassifizierung und Nomenklatur von Enzymen wurde von der Enzymkommission der Internationalen Biochemischen Union entwickelt und auf dem V. Internationalen Biochemischen Kongress 1961 in Moskau genehmigt 2 .

Die Notwendigkeit einer systematischen Nomenklatur wurde vor allem durch die rapide Zunahme der Zahl neu entdeckter Enzyme jedes Jahr diktiert, denen verschiedene Forscher nach eigenem Ermessen Namen gaben. Darüber hinaus wurden manchmal zwei oder mehr Namen für dasselbe Enzym verwendet, was zu Verwirrung in der Nomenklatur führte. Einige Enzymnamen spiegelten überhaupt nicht die Art der katalysierten Reaktion wider.

Bis 1961 gab es keine einheitliche Klassifizierung von Enzymen. Die Schwierigkeit lag darin, dass verschiedene Forscher bei der Klassifizierung von Enzymen unterschiedliche Prinzipien zugrunde legten. Die Kommission prüfte drei Prinzipien, die als Grundlage für die Klassifizierung von Enzymen und deren Bezeichnung dienen könnten. Das erste Prinzip ist die chemische Natur des Enzyms, d. h. die Zugehörigkeit zu Flavoproteinen, Pyridoxalphosphatproteinen, Hämoproteinen, Metalloproteinen usw. Dieses Prinzip konnte jedoch nicht als allgemeine Grundlage für die Klassifizierung dienen, da es nur für eine kleine Anzahl von Enzymen gilt Verfügbare prothetische Gruppen sind bekannte Identifizierung und direkte Definition. Das zweite Prinzip ist die chemische Natur des Substrats, auf das das Enzym einwirkt; Nach diesem Prinzip ist die Klassifizierung eines Enzyms schwierig, da als Substrate verschiedene Verbindungen innerhalb einer bestimmten Stoffklasse (Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Nukleinsäuren) und unzählige Stoffwechselzwischenprodukte dienen können. Die akzeptierte Klassifizierung basiert auf dem dritten Prinzip – der Art der katalysierten Reaktion, die für die Wirkung eines Enzyms spezifisch ist; Es ist logisch, dieses Prinzip als Grundlage für die Klassifizierung und Nomenklatur von Enzymen zu verwenden.

Daher dient die Art der katalysierten chemischen Reaktion in Kombination mit der Bezeichnung des Substrats/der Substrate als Grundlage für die systematische Benennung von Enzymen. Gemäß dieser Klassifizierung werden Enzyme in sechs Hauptklassen eingeteilt: 1) Oxidoreduktasen; 2) Transferasen; 3) Hydrolasen; 4) Lyasen; 5) Isomerasen; 6) Ligasen (Synthetasen).

Oxidoreduktasen. ZU Zur Klasse der Oxidoreduktasen gehören Enzyme, die Redoxreaktionen katalysieren, die der biologischen Oxidation zugrunde liegen. Ihre systematischen Namen haben die Form „Donor:Akzeptor-Oxidoreduktase“, zum Beispiel Laktat:NAD „1“-Oxidoreduktase für LDH.

Folgende Hauptoxidoreduktasen werden unterschieden: aerobe Dehydrogenasen oder Oxidasen, die die Übertragung von Protonen (Elektronen) direkt auf Sauerstoff katalysieren, anaerobe Dehydrogenasen, die die Übertragung von Protonen (Elektronen) auf ein Zwischensubstrat, jedoch nicht auf Sauerstoff, beschleunigen, Cytochrome, die katalysieren nur die Übertragung von Elektronen. Zu dieser Klasse gehören auch die Häm-haltigen Enzyme Katalase und Peroxidase, die Reaktionen unter Beteiligung von Wasserstoffperoxid katalysieren.

Transferasen. Zur Klasse der Transferasen gehören Enzyme, die Reaktionen des intermolekularen Transfers verschiedener Atome, Atomgruppen und Radikale katalysieren. Ihr Name wird in der Form „Spender: transportierte Gruppe – Transferase“ zusammengestellt.

Es gibt Transferasen, die die Übertragung von Ein-Kohlenstoff-Resten, Acyl-, Glykosyl-, Aldehyd- oder Ketonresten, Nukleotidresten, stickstoffhaltigen Gruppen, Phosphor- und Schwefelsäureresten usw. katalysieren. Zum Beispiel: Methyl- und Formyltransferasen, Acetyltransferasen, Aminotransferasen, Phosphotransferasen usw.

Hydrolasen. IN Die Klasse der Hydrolasen umfasst eine große Gruppe von Enzymen, die unter Beteiligung eines Wassermoleküls die Spaltung intramolekularer Bindungen organischer Substanzen katalysieren. Ihr Name setzt sich zusammen aus: „Substrat – Hydrolase“. Dazu gehören: Esterasen – Enzyme, die die Hydrolyse- und Synthesereaktionen von Estern katalysieren; Phosphatasen, die die Hydrolyse von Phosphoanhydrid- und Peptidbindungen beschleunigen; -Andere Anhydridbindungen als Peptidbindungen usw.

Lyasen. Die Klasse der Lyasen umfasst Enzyme, die die Spaltung von C-O-, C-C-, C-N- und anderen Bindungen sowie reversible Reaktionen der Eliminierung verschiedener Gruppen katalysieren

aus Substraten nicht hydrolytisch; Diese Reaktionen gehen mit der Bildung einher“!

Doppelbindung oder durch Hinzufügen von Gruppen an der Stelle der Doppelbindung. Enzyme sind gekennzeichnet*!

werden mit dem Begriff „Substrat-Lyase“ bezeichnet. Zum Beispiel Fumarathydratase (systematisch).

Russischer Name: L-Malat-Hydrolyase) katalysiert die reversible Spaltung von Molekülen;

Wasser aus Apfelsäure zu Fumarsäure. Zur gleichen Gruppe"

umfasst Decarboxylasen (Carboxy-Lyasen), Amidin-Lyasen usw.

Isomerasen. Die Klasse der Isomerasen umfasst Enzyme, die verschiedene katalysieren

Arten von Isomerisierungsreaktionen. Ihr systematischer Name wird unter Berücksichtigung zusammengestellt

Art der Reaktion: „Substrat – cis-trans-Isomerase“. Wenn die Isomerisierung einen intramolekularen Gruppentransfer beinhaltet, wird das Enzym als Mutase bezeichnet.

Zur Klasse der Isomerasen gehören Racemasen und Epimerasen, die auf Amino- und Hydroxysäuren, Kohlenhydrate und deren Derivate einwirken, intramolekulare Oxidoreduktasen, die die gegenseitige Umwandlung von Aldosen und Ketosen katalysieren, intramolekulare Transferasen, die Acyl-, Phosphoryl- und andere Gruppen übertragen usw.

Wimpern (Synthetasen). Zur Klasse der Ligasen gehören Enzyme, die die Synthese organischer Substanzen aus zwei Ausgangsmolekülen katalysieren und dabei die Energie des Abbaus von ATP (oder einem anderen Nukleosidtriphosphat) nutzen. Ihr systematischer Name hat die Form: „X:Y-Ligase“, wobei X und Y die Ausgangssubstanzen bezeichnen. Ein Beispiel ist L-Glutamat: Ammoniakligase (Glutaminsynthetase), unter deren Beteiligung Glutamin aus Glutaminsäure und Ammoniak in Gegenwart von ATP synthetisiert wird.

LISTE DER ENZYME

Basierend auf dem entwickelten System, das sowohl als Grundlage für die Klassifizierung als auch für die Nummerierung (Indexierung) von Enzymen dient, erstellte die Internationale Kommission außerdem eine Enzymklassifikation (EC) einschließlich einer Liste von Enzymen, die bis 1961 zunächst aus etwa 900 Enzymen bestand. Die Liste der Enzyme (siehe Nomenklatur der Enzyme, 1979) umfasste bereits 2142 einzelne Enzyme; Bisher wurden noch mehr identifiziert. In der Liste sind für jedes Enzym neben der Nummer (Code) auch der systematische (rationale) Name, der empfohlene (Arbeits-)Name, die chemische Reaktion, die das Enzym katalysiert, sowie Hinweise zur Spezifität der Wirkung aufgeführt. Es empfiehlt sich, jedem Enzym eine Nummer mit einem vierstelligen Code zuzuordnen.

Somit enthält der Code für jedes Enzym vier durch Punkte getrennte Zahlen und ist nach folgendem Prinzip zusammengestellt. Die erste Ziffer gibt die Nummer einer der sechs Hauptklassen von Enzymen an. Die zweite Zahl bezeichnet eine Unterklasse, die die wichtigsten Substrattypen charakterisiert, die an dieser Art der chemischen Umwandlung beteiligt sind. Bei Transferasen gibt die zweite Ziffer beispielsweise die Art der Gruppe an, die übertragen wird, bei Hydrolasen die Art der zu hydrolysierenden Bindung usw. Diese Unterklassen sind wiederum in spezifischere Untergruppen (bezeichnete Unterklassen) unterteilt, die sich unterscheiden in der chemischen Natur der an dieser Untergruppe von Reaktionen beteiligten Verbindungen (Donoren oder Akzeptoren). An dritter Stelle im Enzymcode steht die Nummer bzw. die Nummer der Unterklasse. Bei Hydrolasen gibt diese Zahl beispielsweise die Art der zu hydrolysierenden Bindung an, bei Lyasen die Art der Abgangsgruppe usw. Die ersten drei Ziffern des Codes geben genau die Art des Enzyms an. Abschließend erhalten alle zu einer bestimmten Unterklasse gehörenden Enzyme eine fortlaufende Nummer in alphabetischer Reihenfolge, die im Code an vierter Stelle steht.

Somit hat jedes Enzym, das durch einen konstanten Satz von vier Zahlen gekennzeichnet ist, einen entsprechenden Code, unter dem es in die Liste der Enzyme aufgenommen wird. Als Beispiel in der Tabelle. 4.5 zeigt zwei Enzyme aus der Liste.

Tabelle 4.5. Fragment	aus der Liste der Enzyme
	Empfohlen		Systematisch	Hinweise zu bestimmten
Chiffre	(Arbeiten)	Reaktion	Name	Krawatten und andere
	Name			Abhängigkeiten
CF 1.1.1.27	Lactatdehyd-	L-Lactat + NAD+ =	L-Lactat:	Oxidiert andere
	Rogenase	Pyruvat + NADH 2	NAD+ -oxidore-	Oxymonocarbonsäure
			Duktase	Säuren
CF 2.6.1.5	Tyrosine-	L-Tyrosin + 2-Oxo-	L-Tyrosin:	Protein Pyridoc-
	abertransferacha	Glutarat = 4-Hydroxyphe-	2-Oxoglutarat	Salphosphat. Feni-
		Nilpyruvat + L-Glu-	Aminotransfer-	Lalanin kann wirken
		Tamat	hinter	handeln statt
				Rosina

Besonders hervorzuheben ist, dass die Internationale Klassifikation der Enzyme nicht als absolut perfekt angesehen werden kann, da sie in mancher Hinsicht nicht der in der organischen Chemie allgemein akzeptierten Klassifikation chemischer Reaktionen entspricht, obwohl Enzyme im Wesentlichen dieselben Reaktionen katalysieren.

Konzept der Enzyme

Enzyme (Enzyme) sind lösliche oder membrangebundene Proteine ​​mit katalytischer Aktivität. ( Zusätzlich zu Proteinen können einige RNA (Ribozyme) und Antikörper (Abzyme) eine katalytische Aktivität im Körper zeigen, sie sind jedoch tausendmal weniger wirksam als Enzyme.) Diese Namen stammen vom lateinischen „fermentatio“ – Fermentation und dem griechischen „ en zym“ – im Sauerteig. Sie erinnern an die ersten Enzymquellen. Biochemie, die Enzyme untersucht, wird genannt Enzymologie. In Diagrammen und Reaktionsgleichungen werden Enzymmoleküle bezeichnet - E. Als Stoffe werden Stoffe bezeichnet, deren Umwandlungen durch Enzyme katalysiert werden Substrate (S). Produkte enzymatische Reaktion bedeutet - R. Da es sich bei Enzymen um Proteine ​​handelt, werden sie mit den gleichen Methoden wie andere Proteine ​​in homogener Form gewonnen. Enzyme zeichnen sich durch physikochemische Eigenschaften aus, die Proteinen innewohnen.

Unterschied zwischen Enzymen und anorganischen Katalysatoren:

a) Reaktionen viel effektiver beschleunigen;

b) mit hoher Wirkungsspezifität ausgestattet;

c) unter physiologischen Bedingungen einer Regulierung unterliegen;

d) unter milden Bedingungen arbeiten.

Die Struktur von Enzymen

Enzyme können sowohl einfache als auch komplexe (konjugierte) Proteine ​​sein, zu denen Lipide, Kohlenhydrate, Metallionen, stickstoffhaltige Basen und Vitaminderivate gehören können. Im Körper können Enzyme sowohl in löslichem Zustand als auch in Form unlöslicher Komplexe wirken oder Teil biologischer Membranen sein.

Eine Besonderheit von Enzymen ist ihre Anwesenheit aktives Zentrum. Aktives Zentrum - Dies ist eine einzigartige Kombination von Aminosäureresten nahe beieinander, die Folgendes bietet:

a) Erkennung des Substratmoleküls,

b) Bindung des Substrats an das Enzym,

c) Durchführung einer katalytischen Transformation (bei einem komplexen Enzym ist auch das Coenzym, das Teil des aktiven Zentrums ist, am Katalysevorgang beteiligt).

Das aktive Zentrum entsteht, wenn sich das Protein faltet und seine native (aktive) Konformation annimmt. Die Struktur des aktiven Zentrums kann sich bei Wechselwirkung mit dem Substrat ändern. Nach dem bildlichen Ausdruck von D. Koshland nähert sich das Substrat dem aktiven Zentrum wie eine Hand einem Handschuh.

Ein Enzymmolekül, insbesondere wenn es aus mehreren Untereinheiten besteht, kann mehr als ein aktives Zentrum enthalten.

Im aktiven Zentrum gibt es zwei Regionen. Die erste Region ist für die Erkennung und Bindung des Substrats verantwortlich. Sie wird als Substratbindungsstelle oder Verankerungsstelle bezeichnet. Der zweite Abschnitt wird als katalytischer Abschnitt bezeichnet; er enthält Aminosäurereste, die am Katalysevorgang beteiligt sind.

Enzyme sind Proteine, die sich hinsichtlich Molekulargewicht und struktureller Komplexität stark unterscheiden. Ein Beispiel für ein niedermolekulares Enzym ist die Ribonuklease, die aus einer einzelnen Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 13.700 Da besteht. (Die Aminosäuresequenz der Ribonuklease wurde bestimmt. 1969 wurde die Ribonuklease im Labor von B. Merrifield in New York synthetisiert.) Viele Enzyme bestehen aus mehreren Untereinheiten, beispielsweise besteht die Laktatdehydrogenase aus vier Untereinheiten zweier Typen. Bisher sind mehrere Multienzymkomplexe bekannt, die aus Dutzenden verschiedener Untereinheiten und mehreren Arten von Coenzymen bestehen. Beispielsweise besteht der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex aus 60 Untereinheiten von drei Arten und fünf Arten von Cofaktoren. Das Molekulargewicht eines solchen Komplexes beträgt je nach Enzymquelle 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Da. Das Enzymmolekül kann kleiner sein als das Substratmolekül. Zum Beispiel: Die Moleküle der Enzyme Amylase und Ribonuklease sind kleiner als die Moleküle ihrer Substrate – Stärke und RNA.

Der Proteinanteil komplexer Enzyme ist katalytisch inaktiv und wird aufgerufen Apoenzym. Die Bindung eines Apoenzyms an eine Nicht-Protein-Komponente führt zur Bildung eines katalytisch aktiven Enzyms (Holoenzym):

Viele Enzyme enthalten ein Metallion, das verschiedene Funktionen erfüllen kann:

a) an der Bindung des Substrats und dem Prozess seiner katalytischen Umwandlung beteiligt sein;

b) die Bindung des Coenzyms an das Enzymmolekül fördern;

c) die Tertiärstruktur des Enzyms stabilisieren (zum Beispiel Ca 2+ in Amylase);

d) durch Bindung an das Substrat unter Bildung eines echten Substrats, auf das das Enzym einwirkt.

Viele Coenzyme sind Derivate von Vitaminen, sodass Stoffwechselstörungen aufgrund eines Vitaminmangels durch eine verminderte Aktivität bestimmter Enzyme verursacht werden.

Einige Enzyme enthalten neben einem aktiven Zentrum allosterisches (regulatorisches) Zentrum - ein Bereich eines Proteinkügelchens außerhalb des aktiven Zentrums, an dem Substanzen binden können, die die enzymatische Aktivität regulieren. Diese Stoffe werden allosterisch genannt Effektoren (allosterische Aktivatoren oder Inhibitoren). Durch die Bindung des Effektors an das allosterische Zentrum kommt es zu einer Veränderung der Struktur des Proteins, die zu einer Veränderung der räumlichen Anordnung der Aminosäurereste im aktiven Zentrum und letztendlich zu einer Veränderung der enzymatischen Aktivität führt .

Enzyme, die im selben Organismus vorkommen und dieselbe chemische Reaktion katalysieren, jedoch unterschiedliche primäre Proteinstrukturen aufweisen, werden Isoenzyme genannt. Isoenzyme unterscheiden sich voneinander in physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Molekulargewicht, thermischer Stabilität, Substratspezifität und elektrophoretischer Mobilität. Die Art des Auftretens von Isoenzymen ist unterschiedlich, meistens jedoch aufgrund von Unterschieden in der Struktur der Gene, die diese Isoenzyme oder ihre Untereinheiten kodieren. Beispielsweise verfügt das Enzym Laktatdehydrogenase (LDH), das die reversible Reaktion der Laktatoxidation zu Pyruvat katalysiert, über vier Untereinheiten der beiden Typen M und H; die Kombination dieser Untereinheiten liegt der Bildung von fünf LDH-Isoenzymen zugrunde (Abb. 1). Zur Diagnose von Herz- und Lebererkrankungen ist es notwendig, das Isoenzymspektrum von LDH im Blutserum zu untersuchen, da LDH 1 und LDH 2 im Herzmuskel und in den Nieren und LDH 4 und LDH 5 in der Skelettmuskulatur aktiv sind und die Leber.

Abb. 1 Struktur verschiedener LDH-Isoenzyme.

Messung der Enzymaktivität

Die Enzymaktivität wird durch Messung der Geschwindigkeit katalysierter Reaktionen bestimmt. Die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen wird anhand der Abnahme der Substratkonzentration bzw. der Zunahme der Produktkonzentration pro Zeiteinheit gemessen:

v = -ΔС S /Δτ , v = ΔC P /Δτ ,

Wo ΔС S– Änderung der molaren Konzentration des Substrats (mol/l),

ΔC P- Änderung der molaren Konzentration des Reaktionsprodukts (mol/l),

Δτ - Zeitänderung (Min, Sek).

Es empfiehlt sich, kinetische Untersuchungen bei sättigenden Konzentrationen des Substrats durchzuführen, da das Enzym sonst nicht die maximale Aktivität entfalten kann.

Einheiten der Enzymaktivität:

Internationale Enzymeinheit (U)- Dies ist die Enzymmenge, die die Umwandlung von 1 µmol Substrat in 1 Minute bei einer Temperatur von 25 °C und dem optimalen pH-Wert der Umgebung katalysiert.

Die SI-Einheit des Enzyms ist gerollt (kat)– Dies ist die Menge an Enzym, die die Umwandlung von einem Mol Substrat in 1 Sekunde katalysiert. Das lässt sich leicht berechnen:

1 U = (1 * 10 -6 M)/60 s = 1,67 * 10 -8 M s-1 = 1,67 * 10 -8 Katze = 16,7 nKat.

Oft definiert spezielle Aktivität Enzympräparate durch Division der Aktivität einer Probe des Enzympräparats, ausgedrückt in (U), durch das Gewicht der Probe in Milligramm:

Ein Schlag = U/Gewicht des Arzneimittels (mg)

Bei der Reinigung von Enzymen erhöht sich die spezifische Aktivität. Durch die Erhöhung der spezifischen Aktivität kann man die Wirksamkeit der Reinigungsstufen und die Reinheit des Enzympräparats beurteilen.

Um die Aktivität hochreiner, homogener Enzympräparate zu beurteilen, wird die Anzahl der internationalen Einheiten (U) des Enzyms in der Probe durch die Menge der Enzymsubstanz (μmol) in dieser Probe dividiert, berechnet molare Aktivität(Geschwindigkeit). Physikalisch gesehen ist die molare Aktivität die Anzahl der Substratmoleküle, die in 1 Minute oder 1 Sekunde eine Umwandlung in ein Enzymmolekül durchlaufen. Zum Beispiel: Für Urease, die die Hydrolyse von Harnstoff beschleunigt, beträgt die molare Aktivität 30.000, Trypsin – 102, Glucoseoxidase – 17.000 Zyklen pro Sekunde.

Eigenschaften von Enzymen

4.1. Wirkmechanismus. Enzyme verschieben das Gleichgewicht katalysierter Reaktionen nicht in Richtung der Bildung von Produkten, daher bleibt die Gleichgewichtskonstante der Reaktion konstant. Wie alle Katalysatoren verkürzen Enzyme lediglich die Zeit, die zum Erreichen dieses Gleichgewichts benötigt wird. In den meisten Fällen beschleunigen Enzyme die Reaktionen um das 10 7- bis 10 14-fache. Die Wirksamkeit der enzymatischen Katalyse beruht auf einer starken Reduzierung der Aktivierungsenergie der Reaktion aufgrund der Umwandlung des Substrats in das Produkt über Übergangszustände.

4.2. Spezifität der Aktion. Die Spezifität der Bindung an das Substrat und der Verlauf der enzymatischen Reaktion werden durch das Apoenzym bestimmt. Die Spezifität der Wirkung von Enzymen bestimmt die Richtung des Stoffwechsels im Körper.

Enzyme sollen es haben enge Substratspezifität, wenn sie auf eine sehr kleine Auswahl an Substraten wirken. Manchmal können wir darüber reden absolute Substratspezifität, Beispielsweise katalysiert Katalase nur eine Reaktion – die Zersetzung von Wasserstoffperoxid:

Die meisten Enzyme sind gekennzeichnet durch relative (breite, Gruppen-) Substratspezifität wenn sie eine Gruppe ähnlicher Reaktionen katalysieren. Beispielsweise katalysiert die Alkoholdehydrogenase die Umwandlung von Alkoholen in Aldehyde, als Substrate können Methanol, Ethanol, Propanol und andere Alkohole fungieren. Eine interessante Tatsache ist, dass Alkoholdehydrogenase nichtlineare Alkohole sowie insbesondere die Alkoholgruppe, die Teil komplexer Moleküle ist, oxidieren kann; dieses Enzym kann die Umwandlung von Retinol in Retinal katalysieren; Naturgemäß katalysieren Enzyme mit breiter Substratspezifität die Umwandlung von Substraten mit unterschiedlicher Effizienz.

Enzyme sind ebenfalls vorhanden stereochemische Spezifität: Ihr aktives Zentrum erkennt Substratmoleküle anhand der räumlichen Konfiguration. Beispielsweise sind L-Aminosäureoxidasen nur gegen L-Aminosäuren aktiv und haben keinerlei Wirkung auf ihre D-Analoga. Für die oxidative Desaminierung von D-Aminosäuren verfügen lebende Organismen über D-Aminosäureoxidasen, die nicht auf L-Aminosäuren einwirken. Es ist die Fähigkeit des aktiven Zentrums, an bestimmte Stereoisomere des Substrats zu binden, die der Funktion von Enzymen wie Racemasen zugrunde liegt, die einige Stereoisomere in andere umwandeln.

Spezifität von Transformationspfaden besteht darin, dass ein Substrat unter Einwirkung verschiedener Enzyme in Produkte umgewandelt werden kann, die sich in Struktur und Rolle im Stoffwechsel unterscheiden.

Hier ist ein Beispiel: L-Aminosäureoxidase wirken auf L-Aminosäuren und wandeln sie unter Bildung von Ammoniak und Wasserstoffperoxid in Alpha-Ketosäuren um.

L-Aminosäure-Decarboxylase binden an die gleichen Substrate, katalysieren aber eine andere Reaktion: die Decarboxylierung unter Bildung biogener Amine und der Freisetzung von Kohlendioxid.

Ein weiteres Beispiel ist die Möglichkeit der Umwandlung von Glucose-6-Phosphat unter Einwirkung verschiedener Enzyme entlang eines der möglichen Stoffwechselwege:

4.3. Thermische Labilität .

Wie viele Proteine ​​unterliegen Enzyme bei steigender Temperatur einer thermischen Denaturierung, was zu einer Störung der nativen Konformation des Enzyms und einer Veränderung der Struktur des aktiven Zentrums führt. Säugetierenzyme beginnen bei Temperaturen über 40 °C merklich zu denaturieren.

In diesem Zusammenhang empfiehlt es sich, Enzympräparate bei niedrigen Temperaturen zu lagern. Eine der besten Möglichkeiten, Enzyme zu konservieren, besteht darin, sie zu lyophilisieren (bei Temperaturen unter -70 °C im Vakuum zu trocknen), sie mithilfe von Ammoniumsalzen in einen teilweise denaturierten Zustand zu überführen und sie in den Kühlschrank zu stellen.

4.4. Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur. Die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen hängt wie bei allen chemischen Reaktionen von der Temperatur ab. Wenn die Temperatur um 10 °C steigt, erhöht sich die Reaktionsgeschwindigkeit gemäß der Van't-Hoff-Regel um das 2- bis 4-fache. Bei Temperaturen über 40 °C kommt es jedoch zu einer erheblichen Denaturierung der Enzyme, was zu einer Abnahme der Gesamtaktivität führt (Abb. 2):

Reis. 2. Abhängigkeit der Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von der Temperatur.

4.5. Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit vom pH-Wert. Die Abhängigkeit der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit vom pH-Wert ist glockenförmig (Abb. 3). Die pH-Werte, bei denen die höchste enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit beobachtet wird, werden als optimal (pH-Optimum) bezeichnet. Die Art der Kurven und der Wert des pH-Optimums hängen von der Art der geladenen Gruppen des Substrats und der geladenen Gruppen des Enzyms (insbesondere derjenigen, die im aktiven Zentrum enthalten sind) ab. Der optimale pH-Wert liegt für die meisten Enzyme im Bereich von 6,0 bis 8,0 (Abb. 3).

Reis. 3. Abhängigkeit der Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion vom pH-Wert.

Es gibt jedoch Ausnahmen, zum Beispiel ist Pepsin bei pH 1,5 – 2,0 am aktivsten und alkalische Phosphatase bei pH 10,0 – 10,5 (Abb. 4).

Reis. 4. Abhängigkeit der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeit (v) vom pH-Wert des Mediums.

Bei extremen (sehr niedrigen oder sehr hohen) pH-Werten wird die Tertiärstruktur des Enzymmoleküls gestört, was zum Verlust der enzymatischen Aktivität führt.

Verwandte Informationen.

Bevor die Eigenschaften von Enzymen und die Abhängigkeit von Enzymen von irgendwelchen Faktoren diskutiert werden, ist es notwendig, das Konzept zu definieren Enzymaktivität.

In der alltäglichen biochemischen Praxis fast Menge wird nicht geschätzt Enzym, sondern nur seine Aktivität. Aktivität ist ein umfassenderes Konzept als Quantität. Es bedeutet zunächst einmal Reaktionsergebnis, nämlich Substratverlust oder AkkumulationProdukt. Dies kann natürlich nicht ignoriert werden Zeit, was das Enzym bewirkt hat und Anzahl der Moleküle Enzym. Da es aber meist unmöglich ist, die Anzahl der Enzymmoleküle zu berechnen, verwenden sie Menge biologisches Material, das ein Enzym enthält (Volumen oder Masse).

Bei der Bestimmung der Enzymaktivität müssen daher drei Faktoren gleichzeitig berücksichtigt werden: Variablen:

• Gewicht das resultierende Produkt oder das verschwundene Substrat,
• Zeit, für Reaktion aufgewendet,
• Menge an Enzym, sondern eigentlich die Masse oder das Volumen des biologischen Materials, das das Enzym enthält.

Die Beziehungen zwischen diesen Faktoren klar und einfach verstehen Beispiel kann dem Bau von zwei Gebäuden dienen. Gebäude dem Reaktionsprodukt entsprechen, Arbeitskräfte- das sind Enzyme Brigade es soll dem Volumen des biologischen Materials entsprechen. Also, Aufgaben ab der 3. Klasse:

1. Ein Team von 10 Personen arbeitete am Bau eines Gebäudes und ein Team von 5 Personen arbeitete an einem anderen ähnlichen Gebäude. Der Bau wurde gleichzeitig und vollständig abgeschlossen. Wo ist die Arbeitsaktivität höher?

2. Ein Team von 10 Personen arbeitete am Bau eines Gebäudes mit 3 Etagen und ein Team von 10 Personen arbeitete am Bau eines anderen Gebäudes mit 12 Etagen. Der Bau wurde gleichzeitig und vollständig abgeschlossen. Wo ist die Arbeitsaktivität höher?

3. Ein Team von 10 Personen arbeitete am Bau eines Gebäudes mit 5 Etagen, und ein Team von 10 Personen arbeitete an einem anderen ähnlichen Gebäude. Der Bau des ersten Gebäudes dauerte 20 Tage, der zweite wurde in 10 Tagen errichtet. Wo ist die Arbeitsaktivität höher?

Grundlagen der Enzymaktivitätsquantifizierung

1. Enzymaktivität ausgedrückt Geschwindigkeit Produktakkumulation oder Substratverlustrate in Bezug auf Materialmenge enthält ein Enzym.

In der Praxis verwenden sie normalerweise:

• Mengeneinheiten einer Substanz – Mol (und seine Derivate mmol, µmol), Gramm (kg, mg),
• Zeiteinheiten – Minute, Stunde, Sekunde,
• Massen- oder Volumeneinheiten - Gramm (kg, mg), Liter (ml).

Auch andere Derivate werden aktiv genutzt – Catal (mol/s), die internationale Aktivitätseinheit (IU, Unit) entspricht µmol/min.

So kann die Enzymaktivität beispielsweise in mmol/s×l, g/h×l, IU/l, cat/ml usw. ausgedrückt werden.

Es ist zum Beispiel bekannt

• was ist 1 g Pepsin baut in einer Stunde 50 kg Eiweiß ab – seine Aktivität beträgt also 50 kg/Stunde pro 1 g Enzym,
• wenn 1,6 ml Speichel 175 kg Stärke pro Stunde abbauen – Aktivität Speichelamylase beträgt 109,4 kg Stärke pro Stunde pro 1 ml Speichel oder 1,82 kg/min×g oder 30,3 g Stärke/s×ml.

2. Schöpfung normale Bedingungen Damit Sie die in verschiedenen Labors erzielten Ergebnisse vergleichen können – optimaler pH-Wert und feste Temperatur, zum Beispiel 25 °C oder 37 °C, unter Beachtung der Inkubationszeit des Substrats mit dem Enzym.

Enzyme sind eine besondere Art von Proteinen, die von Natur aus die Rolle von Katalysatoren für verschiedene chemische Prozesse spielen.

Dieser Begriff wird ständig gehört, jedoch versteht nicht jeder, was ein Enzym oder Enzym ist, welche Funktionen dieser Stoff erfüllt und wie sich Enzyme von Enzymen unterscheiden und ob sie sich überhaupt unterscheiden. Das alles werden wir jetzt herausfinden.

Ohne diese Stoffe wären weder Mensch noch Tier in der Lage, Nahrung zu verdauen. Und zum ersten Mal griff die Menschheit vor mehr als 5.000 Jahren auf den Einsatz von Enzymen im Alltag zurück, als unsere Vorfahren lernten, Milch in „Gefäßen“ aus den Mägen von Tieren aufzubewahren. Unter solchen Bedingungen verwandelte sich Milch unter dem Einfluss von Lab in Käse. Und das ist nur ein Beispiel dafür, wie ein Enzym als Katalysator wirkt, der biologische Prozesse beschleunigt. Enzyme sind heute aus der Industrie nicht mehr wegzudenken, sie sind wichtig für die Herstellung von Zucker, Margarine, Joghurt, Bier, Leder, Textilien, Alkohol und sogar Beton. Auch Waschmittel und Waschpulver enthalten diese nützlichen Stoffe – sie helfen, Flecken bei niedrigen Temperaturen zu entfernen.

Geschichte der Entdeckung

Aus dem Griechischen übersetzt bedeutet Enzym „Sauerteig“. Und die Entdeckung dieser Substanz verdankt die Menschheit dem Niederländer Jan Baptist Van Helmont, der im 16. Jahrhundert lebte. Einst interessierte er sich sehr für die alkoholische Gärung und im Laufe seiner Forschungen entdeckte er eine unbekannte Substanz, die diesen Prozess beschleunigt. Der Niederländer nannte es fermentum, was „Gärung“ bedeutet. Dann, fast drei Jahrhunderte später, kam der Franzose Louis Pasteur, der ebenfalls Fermentationsprozesse beobachtete, zu dem Schluss, dass Enzyme nichts anderes als Substanzen einer lebenden Zelle seien. Und nach einiger Zeit extrahierte der Deutsche Eduard Buchner ein Enzym aus Hefe und stellte fest, dass es sich bei dieser Substanz nicht um einen lebenden Organismus handelte. Er gab ihm auch seinen Namen – „Zimaza“. Einige Jahre später schlug ein anderer Deutscher, Willi Kühne, vor, alle Proteinkatalysatoren in zwei Gruppen einzuteilen: Enzyme und Enzyme. Darüber hinaus schlug er vor, den zweiten Begriff „Sauerteig“ zu nennen, dessen Wirkungen über lebende Organismen hinausgehen. Und erst 1897 setzte allen wissenschaftlichen Auseinandersetzungen ein Ende: Es wurde beschlossen, beide Begriffe (Enzym und Enzym) als absolute Synonyme zu verwenden.

Struktur: Kette aus Tausenden von Aminosäuren

Alle Enzyme sind Proteine, aber nicht alle Proteine ​​sind Enzyme. Enzyme bestehen wie andere Proteine ​​aus. Und das Interessante ist, dass für die Bildung jedes Enzyms einhundert bis eine Million Aminosäuren erforderlich sind, die wie Perlen auf einem Faden aufgereiht sind. Aber dieser Faden ist nie gerade – er ist meist hundertfach gekrümmt. Dadurch entsteht eine dreidimensionale Struktur, die für jedes Enzym einzigartig ist. Mittlerweile handelt es sich bei dem Enzymmolekül um ein relativ großes Gebilde, und nur ein kleiner Teil seiner Struktur, das sogenannte aktive Zentrum, ist an biochemischen Reaktionen beteiligt.

Jede Aminosäure ist durch eine bestimmte Art chemischer Bindung mit einer anderen verbunden, und jedes Enzym hat seine eigene, einzigartige Aminosäuresequenz. Um die meisten davon herzustellen, werden etwa 20 Arten von Aminosubstanzen verwendet. Selbst geringfügige Änderungen in der Aminosäuresequenz können das Aussehen und die „Talente“ eines Enzyms dramatisch verändern.

Biochemische Eigenschaften

Obwohl in der Natur eine Vielzahl von Reaktionen unter Beteiligung von Enzymen ablaufen, können sie alle in 6 Kategorien eingeteilt werden. Dementsprechend läuft jede dieser sechs Reaktionen unter dem Einfluss eines bestimmten Enzymtyps ab.

Reaktionen mit Enzymen:

1. Oxidation und Reduktion.

Die an diesen Reaktionen beteiligten Enzyme werden Oxidoreduktasen genannt. Als Beispiel können wir uns daran erinnern, wie Alkoholdehydrogenasen primäre Alkohole in Aldehyd umwandeln.

1. Gruppenübertragungsreaktion.

Die Enzyme, die diese Reaktionen ermöglichen, werden Transferasen genannt. Sie haben die Fähigkeit, funktionelle Gruppen von einem Molekül auf ein anderes zu übertragen. Dies geschieht beispielsweise, wenn Alanin-Aminotransferasen Alpha-Aminogruppen zwischen Alanin und Aspartat übertragen. Transferasen verschieben auch Phosphatgruppen zwischen ATP und anderen Verbindungen und erzeugen aus Glucoseresten Disaccharide.

1. Hydrolyse.

Die an der Reaktion beteiligten Hydrolasen sind in der Lage, durch Zugabe von Wasserelementen Einfachbindungen aufzubrechen.

1. Entstehung oder Entfernung einer Doppelbindung.

Diese Art von Reaktion erfolgt nicht hydrolytisch unter Beteiligung von Lyase.

1. Isomerisierung funktioneller Gruppen.

Bei vielen chemischen Reaktionen ändert sich die Position einer funktionellen Gruppe innerhalb des Moleküls, aber das Molekül selbst besteht aus der gleichen Anzahl und Art von Atomen wie vor Beginn der Reaktion. Mit anderen Worten, das Substrat und das Reaktionsprodukt sind Isomere. Diese Art der Transformation ist unter dem Einfluss von Isomeraseenzymen möglich.

1. Bildung einer Einfachbindung unter Abspaltung des Wasserelements.

Hydrolasen brechen die Bindung, indem sie dem Molekül Wasserelemente hinzufügen. Lyasen führen die Rückreaktion durch und entfernen den wässrigen Teil von den funktionellen Gruppen. Auf diese Weise entsteht eine einfache Verbindung.

Wie sie im Körper wirken

Enzyme beschleunigen fast alle chemischen Reaktionen, die in Zellen ablaufen. Sie sind für den Menschen lebenswichtig, da sie die Verdauung erleichtern und den Stoffwechsel beschleunigen.

Einige dieser Substanzen helfen dabei, übermäßig große Moleküle in kleinere „Brocken“ zu zerlegen, die der Körper verdauen kann. Andere hingegen binden kleine Moleküle. Wissenschaftlich gesehen sind Enzyme jedoch äußerst selektiv. Das bedeutet, dass jeder dieser Stoffe nur eine bestimmte Reaktion beschleunigen kann. Die Moleküle, mit denen Enzyme „arbeiten“, werden Substrate genannt. Die Substrate wiederum gehen eine Bindung mit einem Teil des Enzyms ein, dem sogenannten aktiven Zentrum.

Es gibt zwei Prinzipien, die die Besonderheiten der Wechselwirkung zwischen Enzymen und Substraten erklären. Beim sogenannten „Key-Lock“-Modell nimmt das aktive Zentrum des Enzyms eine genau definierte Position im Substrat ein. Nach einem anderen Modell ändern beide Reaktionsteilnehmer, das aktive Zentrum und das Substrat, ihre Form, um sich zu verbinden.

Unabhängig vom Prinzip der Wechselwirkung ist das Ergebnis immer das gleiche – die Reaktion unter dem Einfluss des Enzyms läuft um ein Vielfaches schneller ab. Durch diese Wechselwirkung werden neue Moleküle „geboren“, die dann vom Enzym getrennt werden. Und die Katalysatorsubstanz verrichtet weiterhin ihre Arbeit, jedoch unter Beteiligung anderer Partikel.

Hyper- und Hypoaktivität

Es gibt Zeiten, in denen Enzyme ihre Funktionen mit der falschen Intensität ausführen. Übermäßige Aktivität führt zu einer übermäßigen Bildung von Reaktionsprodukten und einem Substratmangel. Die Folge sind eine Verschlechterung des Gesundheitszustandes und schwere Erkrankungen. Die Ursache der Enzymhyperaktivität kann entweder eine genetische Störung oder ein Überschuss an Vitaminen oder Vitaminen sein, die bei der Reaktion verwendet werden.

Eine Unteraktivität von Enzymen kann sogar zum Tod führen, wenn Enzyme beispielsweise Giftstoffe nicht aus dem Körper entfernen oder ein ATP-Mangel auftritt. Die Ursache dieser Erkrankung können auch mutierte Gene oder umgekehrt Hypovitaminose und Mangel an anderen Nährstoffen sein. Darüber hinaus verlangsamt eine niedrigere Körpertemperatur auch die Funktion von Enzymen.

Katalysator und mehr

Heutzutage hört man oft von den Vorteilen von Enzymen. Doch von welchen Stoffen hängt die Leistungsfähigkeit unseres Körpers ab?

Enzyme sind biologische Moleküle, deren Lebenszyklus nicht durch Geburt und Tod bestimmt wird. Sie wirken einfach im Körper, bis sie sich auflösen. Dies geschieht in der Regel unter dem Einfluss anderer Enzyme.

Bei der biochemischen Reaktion werden sie nicht Teil des Endprodukts. Wenn die Reaktion abgeschlossen ist, verlässt das Enzym das Substrat. Danach ist die Substanz wieder einsatzbereit, allerdings an einem anderen Molekül. Und das so lange, wie der Körper es braucht.

Die Einzigartigkeit von Enzymen besteht darin, dass jedes von ihnen nur eine ihm zugewiesene Funktion erfüllt. Eine biologische Reaktion findet nur dann statt, wenn das Enzym das richtige Substrat dafür findet. Dieses Zusammenspiel lässt sich mit dem Funktionsprinzip eines Schlüssels und eines Schlosses vergleichen – nur richtig ausgewählte Elemente können „zusammenarbeiten“. Ein weiteres Merkmal: Sie können bei niedrigen Temperaturen und moderatem pH-Wert wirken und sind als Katalysatoren stabiler als alle anderen Chemikalien.

Enzyme wirken als Katalysatoren, um Stoffwechselprozesse und andere Reaktionen zu beschleunigen.

Typischerweise bestehen diese Prozesse aus spezifischen Schritten, von denen jeder die Arbeit eines bestimmten Enzyms erfordert. Ohne dies kann der Konvertierungs- oder Beschleunigungszyklus nicht abgeschlossen werden.

Die vielleicht bekannteste Funktion von Enzymen ist die eines Katalysators. Das bedeutet, dass Enzyme chemische Reagenzien so kombinieren, dass der Energieaufwand für die schnellere Bildung eines Produkts sinkt. Ohne diese Stoffe würden chemische Reaktionen um ein Hundertfaches langsamer ablaufen. Aber die Fähigkeiten von Enzymen enden hier nicht. Alle lebenden Organismen enthalten die Energie, die sie zum Weiterleben benötigen. Adenosintriphosphat oder ATP ist eine Art geladene Batterie, die Zellen mit Energie versorgt. Aber die Funktion von ATP ist ohne Enzyme nicht möglich. Und das Hauptenzym, das ATP produziert, ist Synthase. Für jedes Molekül Glucose, das in Energie umgewandelt wird, produziert die Synthase etwa 32–34 Moleküle ATP.

Darüber hinaus werden Enzyme (Lipase, Amylase, Protease) in der Medizin aktiv eingesetzt. Sie dienen insbesondere als Bestandteil enzymatischer Präparate wie Festal, Mezim, Panzinorm, Pankreatin zur Behandlung von Verdauungsstörungen. Einige Enzyme können aber auch Einfluss auf den Kreislauf nehmen (Blutgerinnsel auflösen) und die Heilung eitriger Wunden beschleunigen. Und auch in der Krebstherapie greifen sie auf die Hilfe von Enzymen zurück.

Faktoren, die die Enzymaktivität bestimmen

Da das Enzym Reaktionen um ein Vielfaches beschleunigen kann, wird seine Aktivität durch die sogenannte Umsatzzahl bestimmt. Dieser Begriff bezieht sich auf die Anzahl der Substratmoleküle (reagierende Substanz), die ein Enzymmolekül in einer Minute umwandeln kann. Es gibt jedoch eine Reihe von Faktoren, die die Geschwindigkeit der Reaktion bestimmen:

1. Substratkonzentration.

Eine Erhöhung der Substratkonzentration führt zu einer Beschleunigung der Reaktion. Je mehr Moleküle des Wirkstoffs vorhanden sind, desto schneller läuft die Reaktion ab, da mehr aktive Zentren beteiligt sind. Allerdings ist eine Beschleunigung nur so lange möglich, bis alle Enzymmoleküle verbraucht sind. Danach wird selbst eine Erhöhung der Substratkonzentration die Reaktion nicht beschleunigen.

1. Temperatur.

Typischerweise beschleunigt eine Erhöhung der Temperatur die Reaktionen. Diese Regel gilt für die meisten enzymatischen Reaktionen, solange die Temperatur nicht über 40 Grad Celsius steigt. Ab dieser Marke beginnt die Reaktionsgeschwindigkeit dagegen stark abzunehmen. Sinkt die Temperatur unter einen kritischen Wert, nimmt die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktionen wieder zu. Steigt die Temperatur weiter an, brechen die kovalenten Bindungen auf und die katalytische Aktivität des Enzyms geht für immer verloren.

1. Säure.

Die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen wird auch vom pH-Wert beeinflusst. Jedes Enzym hat seinen eigenen optimalen Säuregehalt, bei dem die Reaktion am besten abläuft. Eine Änderung des pH-Wertes beeinflusst die Aktivität des Enzyms und damit die Geschwindigkeit der Reaktion. Sind die Veränderungen zu groß, verliert das Substrat seine Bindungsfähigkeit an den aktiven Zellkern und das Enzym kann die Reaktion nicht mehr katalysieren. Mit der Wiederherstellung des erforderlichen pH-Wertes wird auch die Enzymaktivität wiederhergestellt.

Die im menschlichen Körper vorhandenen Enzyme können in zwei Gruppen eingeteilt werden:

• Stoffwechsel;
• Verdauungs.

Der Stoffwechsel „arbeitet“ an der Neutralisierung toxischer Substanzen und trägt auch zur Produktion von Energie und Proteinen bei. Und natürlich beschleunigen sie biochemische Prozesse im Körper.

Wofür die Verdauungsorgane zuständig sind, geht aus dem Namen hervor. Aber auch hier kommt das Prinzip der Selektivität zum Tragen: Eine bestimmte Enzymart wirkt nur auf eine Lebensmittelart. Um die Verdauung zu verbessern, können Sie daher auf einen kleinen Trick zurückgreifen. Wenn der Körper etwas aus der Nahrung nicht gut verdaut, ist es notwendig, die Ernährung mit einem Produkt zu ergänzen, das ein Enzym enthält, das schwer verdauliche Nahrung abbauen kann.

Lebensmittelenzyme sind Katalysatoren, die die Nahrung in einen Zustand zerlegen, in dem der Körper nützliche Substanzen daraus aufnehmen kann. Verdauungsenzyme gibt es in verschiedenen Arten. Im menschlichen Körper kommen verschiedene Arten von Enzymen in verschiedenen Teilen des Verdauungstrakts vor.

Mundhöhle

In diesem Stadium wird das Lebensmittel der Alpha-Amylase ausgesetzt. Es zersetzt Kohlenhydrate, Stärke und Glukose, die in Kartoffeln, Obst, Gemüse und anderen Lebensmitteln enthalten sind.

Magen

Hier zerlegt Pepsin Proteine ​​in Peptide und Gelatinase zersetzt im Fleisch enthaltene Gelatine und Kollagen.

Pankreas

In diesem Stadium „arbeiten“ sie:

• Trypsin – verantwortlich für den Abbau von Proteinen;
• Alpha-Chymotrypsin – hilft bei der Verdauung von Proteinen;
• Elastasen – bauen einige Arten von Proteinen ab;
• Nukleasen – helfen beim Abbau von Nukleinsäuren;
• Stepsin – fördert die Aufnahme von fetthaltigen Nahrungsmitteln;
• Amylase – verantwortlich für die Absorption von Stärke;
• Lipase – spaltet Fette (Lipide), die in Milchprodukten, Nüssen, Ölen und Fleisch enthalten sind.

Dünndarm

Sie „zaubern“ Speisereste:

• Peptidasen – bauen Peptidverbindungen auf die Ebene von Aminosäuren ab;
• Sucrase – hilft bei der Verdauung komplexer Zucker und Stärke;
• Maltase – spaltet Disaccharide in Monosaccharide (Malzzucker);
• Laktase – spaltet Laktose (Glukose, die in Milchprodukten enthalten ist);
• Lipase – fördert die Aufnahme von Triglyceriden und Fettsäuren;
• Erepsin – beeinflusst Proteine;
• Isomaltase – „funktioniert“ mit Maltose und Isomaltose.

Doppelpunkt

Hier werden die Funktionen von Enzymen wahrgenommen durch:

• Escherichia coli – verantwortlich für die Verdauung von Laktose;
• Laktobazillen – beeinflussen Laktose und einige andere Kohlenhydrate.

Zusätzlich zu den oben genannten Enzymen gibt es noch:

• Diastase – verdaut Pflanzenstärke;
• Invertase – baut Saccharose (Haushaltszucker) ab;
• Glucoamylase – wandelt Stärke in Glukose um;
• Alpha-Galaktosidase – fördert die Verdauung von Bohnen, Samen, Sojaprodukten, Wurzel- und Blattgemüse;
• Bromelain – ein aus Bromelain gewonnenes Enzym, das den Abbau verschiedener Arten von Proteinen fördert, bei unterschiedlichem Säuregehalt der Umwelt wirksam ist und entzündungshemmende Eigenschaften hat;
• Papain ist ein aus roher Papaya isoliertes Enzym, das den Abbau kleiner und großer Proteine ​​fördert und bei einer Vielzahl von Substraten und Säuren wirksam ist.
• Cellulase – baut Zellulose und Pflanzenfasern ab (die im menschlichen Körper nicht vorkommen);
• Endoprotease – spaltet Peptidbindungen;
• Ochsengallenextrakt – ein Enzym tierischen Ursprungs, stimuliert die Darmmotilität;
und andere Mineralien;
• Xylanase – baut Glukose aus Getreide ab.

Katalysatoren in Produkten

Enzyme sind für die Gesundheit von entscheidender Bedeutung, da sie dem Körper dabei helfen, Nahrungsbestandteile in einen für die Nährstoffe verwertbaren Zustand zu zerlegen. Der Darm und die Bauchspeicheldrüse produzieren eine Vielzahl von Enzymen. Aber auch in manchen Lebensmitteln sind viele ihrer verdauungsfördernden Wirkstoffe enthalten.

Fermentierte Lebensmittel sind eine nahezu ideale Quelle für nützliche Bakterien, die für eine gute Verdauung notwendig sind. Und während pharmazeutische Probiotika nur im oberen Teil des Verdauungssystems „wirken“ und oft nicht in den Darm gelangen, ist die Wirkung enzymatischer Produkte im gesamten Magen-Darm-Trakt spürbar.

Aprikosen enthalten beispielsweise eine Mischung nützlicher Enzyme, darunter Invertase, die für den Abbau von Glukose verantwortlich ist und die schnelle Energiefreisetzung fördert.

Avocado kann als natürliche Lipasequelle dienen (fördert eine schnellere Verdauung von Lipiden). Im Körper wird dieser Stoff von der Bauchspeicheldrüse produziert. Doch um diesem Organ das Leben zu erleichtern, kann man sich zum Beispiel einen Salat mit Avocado gönnen – lecker und gesund.

Bananen sind nicht nur die vielleicht bekannteste Kaliumquelle, sondern versorgen den Körper auch mit Amylase und Maltase. Amylase kommt auch in Brot, Kartoffeln und Getreide vor. Maltase hilft beim Abbau von Maltose, dem sogenannten Malzzucker, der reichlich in Bier und Maissirup vorkommt.

Ananas, eine weitere exotische Frucht, enthält eine ganze Reihe von Enzymen, darunter Bromelain. Und einigen Studien zufolge hat es auch krebshemmende und entzündungshemmende Eigenschaften.

Extremophile und Industrie

Extremophile sind Substanzen, die unter extremen Bedingungen lebenswichtige Funktionen aufrechterhalten können.

Lebende Organismen sowie die Enzyme, die ihnen ihre Funktion ermöglichen, wurden in Geysiren gefunden, wo die Temperatur nahe am Siedepunkt liegt, und tief im Eis sowie unter Bedingungen extremen Salzgehalts (Death Valley in den USA). Darüber hinaus haben Wissenschaftler Enzyme gefunden, bei denen der pH-Wert, wie sich herausstellt, ebenfalls keine Grundvoraussetzung für eine effektive Wirkungsweise ist. Forscher untersuchen besonders extremophile Enzyme als Substanzen, die in der Industrie weit verbreitet eingesetzt werden können. Obwohl Enzyme bereits heute als biologisch und umweltfreundliche Substanzen in der Industrie Verwendung finden. Enzyme werden in der Lebensmittelindustrie, der Kosmetik und der Herstellung von Haushaltschemikalien eingesetzt.

Darüber hinaus sind die „Dienste“ von Enzymen in solchen Fällen günstiger als synthetische Analoga. Darüber hinaus sind Naturstoffe biologisch abbaubar, was ihren Einsatz umweltfreundlich macht. In der Natur gibt es Mikroorganismen, die Enzyme in einzelne Aminosäuren abbauen können, die dann zu Bestandteilen einer neuen biologischen Kette werden. Aber das ist, wie man sagt, eine ganz andere Geschichte.

Enzyme sind biologische Katalysatoren, hochmolekulare Proteinsubstanzen, die von einer lebenden Zelle produziert werden. Sie sind streng spezifisch und spielen eine wichtige Rolle im Stoffwechsel von Mikroorganismen. Ihre Spezifität hängt mit aktiven Zentren zusammen, die aus einer Gruppe von Aminosäuren bestehen, d. h. jedes Enzym reagiert mit einer bestimmten chemischen Verbindung oder katalysiert eine oder mehrere verwandte chemische Reaktionen. Zum Beispiel: Das Enzym Laktase spaltet Laktose, Maltase spaltet Maltose usw.

Exoenzyme – in das äußere System freigesetzt – Endoenzyme – bauen Makromoleküle von Nährstoffen in Stoffwechselreaktionen teilweise zu einfacheren Verbindungen ab, die von der mikrobiellen Zelle aufgenommen werden können (Exoenzyme der Hydrolyse bewirken die Hydrolyse von Fetten, Proteinen, Kohlenhydraten).

Die Enzymzusammensetzung von Mikroorganismen ist konstant und verschiedene Mikrobenarten unterscheiden sich deutlich in der Menge der Enzyme. Daher ist die Untersuchung der enzymatischen Zusammensetzung wichtig für die Identifizierung verschiedener Mikroorganismen.

Praktische Nutzung der enzymatischen Eigenschaften von Mikroben: Fermentationsprozesse, Pilze beim Brauen und Weinbereiten, Verarbeitung von Häuten, zum Weichmachen; Einmachen. Herstellung biologischer Zusatzstoffe für Waschpulver zur Entfernung von Proteinverunreinigungen, da diese Proteine ​​in wasserlösliche zerlegen.

Vitamine, Hormone und Alkalosen werden mithilfe von Enzymen gewonnen.

Stoffe, die im Inneren der Zelle vorkommen.

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IN Bei der lebenswichtigen Aktivität von Bakterien spielen Enzyme eine wichtige Rolle, da sie obligatorische Teilnehmer an verschiedenen biochemischen Reaktionen sind, die den Funktionen Ernährung, Atmung und Fortpflanzung zugrunde liegen.

Die Stabilität bakterieller Enzymsysteme ermöglicht die Nutzung ihrer biochemischen Eigenschaften in Kombination mit morphologischen und kulturellen Merkmalen zur Bestimmung der Arten von Mikroorganismen.

Zum Nachweis von Enzymen werden ausschließlich Reinkulturen von Mikroorganismen verwendet, die auf spezielle differenzialdiagnostische Medien geimpft werden. Bei der Untersuchung der biochemischen Aktivität von Bakterien sind saccharolytische, proteolytische und Redoxenzyme von größter Bedeutung.

Saccharolytische Enzyme von Mikroben. Die saccharolytische Aktivität von Mikroorganismen wird durch den enzymatischen Abbau mehrwertiger Alkohole und Kohlenhydrate bei der Beimpfung auf differenzialdiagnostische Medien bestimmt. Unter optimalen Bedingungen gehen verschiedene Arten von Mikroben mit demselben Zucker unterschiedlich um, indem sie einige abbauen und anderen gegenüber neutral bleiben. Diese Eigenschaft von Mikroben wird in der bakteriologischen Praxis genutzt, um verschiedene Arten und Sorten von Bakterien zu unterscheiden.

Auf festen, flüssigen und halbflüssigen Nährmedien, die verschiedene Indikatoren (am häufigsten Andredes Indikator) enthalten, werden Zucker durch die Wirkung saccharolytischer Enzyme von Bakterien in Aldehyde und Säuren zerlegt. Die Endprodukte ihres Abbaus sind Kohlendioxid und Wasserstoff. Durch die Anreicherung von Säuren sinkt der pH-Wert des Nährmediums, was zu einer Farbveränderung des Indikators und des Mediums selbst führt. Wenn Bakterien für ein bestimmtes Kohlenhydrat kein Enzym absondern, ändert sich die Farbe des Indikators und des Nährmediums nicht. Daher wird ein Satz Nährmedien mit Indikatoren als bunte oder farbige Serie bezeichnet.

Um saccharolytische Enzyme nachzuweisen, wird die untersuchte Bakterienkultur am häufigsten in farbige Medien („bunte Serien“) von Hiss (Rec. 15) mit Kohlenhydraten und Andrede-Indikator (Rec. 16) oder BP-Indikator (eine Mischung aus wässrigem Blau mit) inokuliert Rosolsäure). Hiss‘ „Motley Row“ enthält normalerweise fünf Reagenzgläser; mit Glucose, Lactose, Mannitol, Maltose und Saccharose. In einigen Fällen wird die „bunte Reihe“ von Hiss für eine tiefergehende Untersuchung der biochemischen Eigenschaften von Mikroorganismen durch Dulcit, Sorbitol, Xylose und Arabinose ergänzt. Zucker, die zum Nachweis saccharolytischer Enzyme verwendet werden, müssen chemisch rein sein.

Hiss-Medien können flüssig oder halbflüssig sein (mit Zusatz von 0,5 % Agar-Agar). Ein Gärröhrchen (Schwimmer), ein an einem Ende verschlossenes Glasrohr, wird in Reagenzgläser mit flüssigen Nährmedien abgesenkt. Bei der Sterilisation wird der Schwimmer vollständig mit dem Nährmedium gefüllt. Wenn sich im Medium gasförmige Produkte bilden, verdrängen diese Flüssigkeit aus dem Schwimmer und bilden eine Luftglocke. In halbflüssigen Medien wird die Gasbildung durch das Vorhandensein von Blasen in der Dicke des Mediums bestimmt.

Proteolytische Enzyme von Mikroben. Einige Mikroorganismen produzieren proteolytische Enzyme, die den Proteinabbau katalysieren, und geben sie an die äußere Umgebung ab. Durch den Abbau des Proteinmoleküls entstehen hochmolekulare Zwischenabbauprodukte – Peptone, Aminosäuren und Polypeptide.

Um proteolytische Enzyme zu identifizieren, wird die untersuchte Mikroorganismenkultur in ein Nährmedium geimpft, das ein bestimmtes Protein enthält. Am häufigsten wird zu diesem Zweck Gelatine verwendet, seltener geronnene Pferdemolke, geronnenes Eiweiß, Milch oder gekochte Fleischstücke.

Um die proteolytische Aktivität von Mikroorganismen auf Gelatine zu bestimmen, wird Fleisch-Pepton-Gelatine (Empfehlung 17) hergestellt und in Reagenzgläser in einer Säule von 5–6 ml gegossen. Nach dem Aushärten des Nährmediums erfolgt die Aussaat durch Injektion, wobei die Öse bis zum Boden des Reagenzglases tief in das Nährmedium eingetaucht wird.

Mikroben, die bei niedrigen Temperaturen wachsen können, werden bei 20°C-22°C inkubiert. Die restlichen Pflanzen werden bei 37°C inkubiert. Bei einer Temperatur von 37 °C schmilzt die Gelatine. Nach der Inkubation werden die entnommenen Reagenzgläser in einen Kühlschrank oder in kaltes Wasser gestellt, um das Medium zu verfestigen. Nachdem sich das Medium verfestigt hat, beginnen sie, die Ergebnisse des Wachstums der Mikroorganismen zu beobachten. Bei der Freisetzung des proteolytischen Enzyms Gelatinase kommt es zum Abbau von Proteinen und zur Verflüssigung des Nährmediums, mit einem für bestimmte Arten von Mikroorganismen charakteristischen Muster (Abb. 37). Beispielsweise verflüssigt Anthraxbazillus Gelatine in Form eines Trichters, Staphylokokken – in Form eines Strumpfes, Pseudomonas aeruginosa – in Schichten usw.

ENZYMATISCHE AKTIVITÄT VON MIKROORGANISMEN

Verschiedene Formen der Gelatineverflüssigung durch Mikroorganismen

Bestimmung der proteolytischen Aktivität von Mikroben auf Eijkman-Milchagar. Bereiten Sie Eijkman-Milchagar vor, indem Sie 3 ml Magermilch zu 10 ml sterilem, geschmolzenem Nähragar hinzufügen und mischen. Eijkman-Milchagar (Rezept. 18) wird in Petrischalen gegossen und nach dem Abkühlen mit einer Öse oder einem Spatel mit dem zu untersuchenden Mikroorganismus beimpft, um isolierte Kolonien zu erhalten. Nach 24–48 Stunden Inkubation in einem Thermostat zersetzen Kulturen, die proteolytische Enzyme produzieren, das Milchprotein – Kasein, was zur Bildung klarer transparenter Zonen um die Kolonien vor dem Hintergrund eines trüben Nährmediums führt.

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Vorlesung Nr. 3. Chemische Struktur, biochemische Eigenschaften und Enzyme von Bakterien.

Eine Zelle ist eine universelle Einheit lebender Materie. Es gibt keine signifikanten Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung prokaryotischer und eukaryotischer Zellen.

Die chemischen Elemente, aus denen lebende Materie besteht, können in drei Hauptgruppen eingeteilt werden.

1.Biogen chemische Elemente (C, O, N, H). Sie machen 95 % des Trockenrückstandes aus, inkl. 50 % – C, 20 % – O, 15 % – N, 10 % – H).

2.Makronährstoffe- P, S, Cl, K, Mg, Ca, Na. Sie machen etwa 5 % aus.

3.Mikroelemente- Fe, Cu, I, Co, Mo usw. Sie machen Bruchteile eines Prozents aus, sind aber bei Stoffwechselprozessen wichtig.

Chemische Elemente sind Bestandteil verschiedener Stoffe – Wasser, Proteine, Lipide, Neutralfette, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren. Die Synthese von Verbindungen wird durch Gene gesteuert. Die Bakterienzelle kann viele Stoffe von außen aufnehmen – aus der Umwelt oder dem Wirtsorganismus.

Wasser macht 70 bis 90 % der Biomasse aus. Der Wassergehalt ist bei Kapselbakterien höher und bei Sporen am geringsten.

Eichhörnchen kommt in allen Strukturelementen der Zelle vor. Proteine ​​können einfacher (Proteine) oder komplex (Proteine) sein, in reiner Form oder in Kombination mit Lipiden und Zuckern. Es gibt strukturelle (strukturbildende) und funktionelle (regulatorische) Proteine, zu letzteren zählen auch Enzyme.

Enthält Proteine umfasst sowohl bei Eukaryoten übliche als auch ursprüngliche Aminosäuren – Diaminopimelin, D-Alanin, D-Glutanin, in den Peptidoglykanen und Kapseln einiger Bakterien enthalten. Nur im Streit Dipicolinsäure, was mit einer hohen Sporenresistenz verbunden ist. Flagellen bestehen aus Protein Flagellina, das Kontraktilität und ausgeprägte antigene Eigenschaften aufweist. Pili (Zotten) enthalten ein besonderes Protein – Pilin.

Kapseln von Vertretern der Gattung Bacillus, dem Erreger der Pest, und Oberflächenantigene einer Reihe von Bakterien, darunter Staphylokokken und Streptokokken, haben peptidischen Charakter. Protein A- ein spezifisches Protein von S. aureus – ein Faktor, der eine Reihe von Eigenschaften dieses Erregers bestimmt. Protein M- ein spezifisches Protein hämolytischer Streptokokken der Serogruppe A, das die Differenzierung von Serovaren (ca. 100) ermöglicht, was von epidemiologischer Bedeutung ist.

Die äußere Membran gramnegativer Bakterien enthält eine Reihe von Proteinen, davon 3–4 wesentlich(groß) und mehr als 10 kleinere, die verschiedene Funktionen erfüllen. Zu den wichtigsten Proteinen gehören: Porine Sie bilden diffuse Poren, durch die kleine hydrophile Moleküle in die Zelle eindringen können.

Proteine ​​sind enthalten Peptidoglycan- ein Biopolymer, das die Grundlage der bakteriellen Zellwand bildet. Es besteht aus einem Rückgrat (abwechselnde Moleküle aus zwei Aminozuckern) und zwei Sätzen von Peptidketten – seitlich und quer. Das Vorhandensein zweier Arten von Bindungen – glykosidische (zwischen Aminozuckern) und peptidische Bindungen, die Peptidoglycan-Untereinheiten verbinden – verleiht diesem Heteropolymer seine Struktur molekulares Netzwerk. Peptidoglycan ist die stabilste Verbindung, die ein starres, sackartiges Makromolekül bildet, das die dauerhafte Form von Bakterien und eine Reihe ihrer Eigenschaften bestimmt..

1. Peptidoglycan enthält gattungs- und artspezifische antigene Determinanten.

2. Es löst die klassischen und alternativen Aktivierungswege des Komplementsystems aus.

3. Peptidoglycan hemmt die phagozytische Aktivität und die Migration von Makrophagen.

4. Es ist in der Lage, die Entwicklung einer Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ (DTH) auszulösen.

5. Peptidoglycan hat eine Antitumorwirkung.

6. Es hat eine pyrogene Wirkung, d.h. verursacht Fieber.

Von den Verbindungen von Proteinen mit Nicht-Protein-Bestandteilen sind die wichtigsten Lipoproteine, Glykoproteine ​​und Nukleoproteine.

Ein erstaunliches Geheimnis des Lebens – die Proteinsynthese findet statt Ribosomen. Es gibt zwei Haupttypen von Ribosomen – 70S (S-Sedimentationskonstante, Svedberg-Einheit) und 80S. Ribosomen vom Typ 1 kommen nur in Prokaryoten vor. Antibiotika haben keinen Einfluss auf die Proteinsynthese in Ribosomen des 80S-Typs, der bei Eukaryoten häufig vorkommt.

Lipide(hauptsächlich Phospholipide) kommen in der Zytoplasmamembran (Lipiddoppelschicht) sowie in der Außenmembran gramnegativer Bakterien vor. Es gibt Mikroorganismen, die eine große Menge an Lipiden (bis zu 40 % Trockenmasse) enthalten – Mykobakterien. Lipide enthalten verschiedene Fettsäure, sehr spezifisch für verschiedene Gruppen von Mikroorganismen. Ihre Bestimmung ist in manchen Fällen von diagnostischem Wert, beispielsweise bei Anaerobiern und Mykobakterien.

Mycobacterium tuberculosis enthält in seinen Lipiden eine Reihe säurebeständiger Fettsäuren – phthionisch, mykolisch usw. Der hohe Gehalt an Lipiden und ihre Zusammensetzung bestimmen viele Eigenschaften von Mycobacterium tuberculosis:

Beständigkeit gegen Säuren, Laugen und Alkohole;

Schwierig mit Farbstoffen zu bemalen (es werden spezielle Färbemethoden verwendet, am häufigsten nach Ziehl-Neelsen);

Resistenz des Erregers gegenüber Sonneneinstrahlung und Desinfektionsmitteln;

- Pathogenität.

Teichonsäuren kommt in den Zellwänden grampositiver Bakterien vor.

Es handelt sich um wasserlösliche lineare Polymere, die Glycerin- oder Ribolreste enthalten, die durch Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Die Hauptoberflächenantigene einer Reihe grampositiver Bakterien sind mit Teichonsäuren assoziiert.

Kohlenhydrate kommt häufiger in der Form vor Polysaccharide, die exo- und endozellulär sein können. Unter den exozellulären Polysacchariden werden Rahmenpolysaccharide (Bestandteil von Kapseln) und echte Exopolysaccharide (Austritt in die äußere Umgebung) unterschieden. Unter den bakteriellen Polysacchariden finden viele medizinische Verwendung. Dextrans- Polysaccharide mit hohem Molekulargewicht, die im Aussehen an Schleim erinnern. 6%ige Lösung - Blutersatz Polyglucin. Dextran-Gel Sephadex Wird in der Säulenchromatographie als Molekularsieb verwendet. Endozelluläre Polysaccharide sind die Reservenährstoffe der Zelle (Stärke, Glykogen usw.).

Lipopolysaccharid (LPS)- einer der Hauptbestandteile der Zellwand gramnegativer Bakterien, eine Kombination aus Lipid und Polysaccharid. LPS besteht aus einem Komplex:

1.Lipid A.

2. Das Gleiche gilt für alle gramnegativen Bakterien Polysaccharidkern.

3.Terminale Saccharidkette ( O-spezifische Seitenkette).

Synonyme: LPS – Endotoxin, O – Antigen.

LPS erfüllt zwei Hauptfunktionen: Es bestimmt die Antigenspezifität und ist einer der Hauptfaktoren der Pathogenität. Es handelt sich um ein Endotoxin, dessen toxische Wirkung sich vor allem in der Zerstörung von Bakterienzellen äußert. Seine Toxizität wird durch Lipid A bestimmt. LPS löst die Synthese von mehr als 20 biologisch aktiven Substanzen aus, die die Pathogenese der Endotoxämie bestimmen, und hat eine pyrogene Wirkung.

Nukleinsäuren- DNA und RNA. Ribonukleinsäuren(RNA) kommen hauptsächlich in Ribosomen vor (r-RNA – 80–85 %), t (Transport) – RNA – 10 %, m (Vorlage) – RNA – 1–2 %, hauptsächlich in einzelsträngiger Form. DNA (Desoxyribonukleinsäure) kann sich im Kernapparat (chromosomale DNA) oder im Zytoplasma in spezialisierten Formationen befinden – Plasmide – Plasmid-DNA (extrachromosomale DNA). Mikroorganismen unterscheiden sich in der Struktur und dem Inhalt von Nukleinsäuren stickstoffhaltige Basen. Der genetische Code besteht nur aus vier Buchstaben (Basen) – A (Adenin), T (Thymin), G (Guanin) und C (Cytosin). Am häufigsten wird zur Charakterisierung von Mikroorganismen das prozentuale G/C-Verhältnis als taxonomisches Merkmal verwendet, das sich in verschiedenen Gruppen von Mikroorganismen erheblich unterscheidet.

Mikroorganismen synthetisieren verschiedene Enzyme- spezifische Proteinkatalysatoren. Wird in Bakterien gefunden Enzyme von 6 Hauptklassen.

1. Oxidoreduktasen – katalysieren Redoxreaktionen.

2. Transferasen – führen Reaktionen zur Übertragung von Atomgruppen durch.

3.Hydrolasen – führen den hydrolytischen Abbau verschiedener Verbindungen durch.

4.Lyasen – katalysieren Reaktionen der Abspaltung einer chemischen Gruppe von einem Substrat auf nichthydrolytische Weise unter Bildung einer Doppelbindung oder der Addition einer chemischen Gruppe an Doppelbindungen.

5. Ligasen oder Synthetasen – sorgen für die Verbindung zweier Moleküle, verbunden mit der Spaltung der Pyrophosphatbindung im ATP-Molekül oder einem ähnlichen Triphosphat.

6.Isomerasen – bestimmen die räumliche Anordnung von Elementgruppen.

Entsprechend den Mechanismen der genetischen Kontrolle bei Bakterien werden drei Gruppen von Enzymen unterschieden:

— konstitutiv, deren Synthese ständig erfolgt;

- induzierbar, dessen Synthese durch die Anwesenheit eines Substrats induziert wird;

- repressiv, dessen Synthese durch einen Überschuss des Reaktionsprodukts unterdrückt wird.

Bakterielle Enzyme werden unterteilt in Exo- und Endoenzyme. Exoenzyme werden in die äußere Umgebung freigesetzt und führen die Prozesse des Abbaus hochmolekularer organischer Verbindungen durch. Die Fähigkeit zur Bildung von Exoenzymen bestimmt maßgeblich Invasivität Bakterien – die Fähigkeit, Schleim-, Bindegewebe- und andere Gewebebarrieren zu durchdringen.

Beispiele: Hyaluronidase baut Hyaluronsäure ab, die Teil der Interzellularsubstanz ist und die Gewebepermeabilität erhöht (Clostridien, Streptokokken, Staphylokokken und viele andere Mikroorganismen); Neuraminidase erleichtert die Überwindung der Schleimschicht, das Eindringen in die Zellen und die Ausbreitung im Interzellularraum (Vibrio cholera, Diphtheriebazillus, Influenzavirus und viele andere). Zu dieser Gruppe gehören auch Enzyme, die Antibiotika abbauen.

In der Bakteriologie sind für die Differenzierung von Mikroorganismen anhand biochemischer Eigenschaften häufig die Endprodukte und Ergebnisse der Wirkung von Enzymen von größter Bedeutung. Dementsprechend gibt es mikrobiologische (Arbeits-)Klassifizierung von Enzymen.

1.Saccharolytisch.

2. Proteolytisch.

3.Autolytisch.

4. Oxidations-Reduktion.

5. Pathogenität (Virulenz) von Enzymen.

Die Enzymzusammensetzung einer Zelle wird durch das Genom bestimmt und ist ein ziemlich konstantes Merkmal. Die Kenntnis der biochemischen Eigenschaften von Mikroorganismen ermöglicht deren Identifizierung durch eine Reihe von Enzymen. Die Hauptprodukte der Fermentation von Kohlenhydraten und Proteinen sind Säure, Gas, Indol und Schwefelwasserstoff, obwohl das tatsächliche Spektrum für verschiedene Mikroorganismen viel umfangreicher ist.

Die wichtigsten Virulenzenzyme sind Hyaluronidase, Plasmakoagulase, Lecithinase, Neuraminidase und DNAase. Die Bestimmung pathogener Enzyme ist wichtig für die Identifizierung einer Reihe von Mikroorganismen und die Identifizierung ihrer Rolle in der Pathologie.

Eine Reihe mikrobieller Enzyme werden in der Medizin und Biologie häufig zur Herstellung verschiedener Substanzen (autolytisch, proteolytisch) und in der Gentechnik (Restriktionsenzyme, Ligasen) eingesetzt.

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Bakterielle Enzyme. Enzymaktivität

Bakterielle Enzyme Enzyme sind hochspezifische biologische Katalysatoren, ohne die Leben und Fortpflanzung unmöglich sind. Die große Anzahl an Reaktionen, die während des Lebens einer Bakterienzelle ablaufen, weist auf die Existenz einer erheblichen Anzahl von Enzymen in Bakterien hin. Enzyme sind Eiweißstoffe mit hohem Molekulargewicht. Einige davon sind Proteine, andere sind komplexe Proteine. Sie bestehen aus zwei Proteinteilen und einem Nicht-Proteinteil, der als Prothesengruppe bezeichnet wird. Es kann Vitamine enthalten. Nukleotide, Eisenatome usw. Die Verbindung zwischen dem Proteinteil des Enzyms und der prosthetischen Gruppe kann stark oder brüchig sein. Liegt in Lösungen eine schwache Bindung vor, kommt es zur Dissoziation des Enzyms und eine freie prosthetische Gruppe kann freigesetzt werden.
Leicht dissoziierende irosthetische Enzymgruppen werden Coenzyme genannt. Enzyme werden üblicherweise in die folgenden Hauptgruppen eingeteilt:

1. Oxidoreduktasen. alle Enzyme, die Redoxreaktionen katalysieren.
2. Transferasen. Katalysieren der Übertragung bestimmter Gruppen (z. B. Aminogruppen, Phosphatreste usw.)
3.

Methoden zur Untersuchung der enzymatischen Aktivität von Bakterien.

Hydrolasen, die GT oder andere Verbindungen durch Hydrolyse abbauen; Zu dieser Klasse gehören auch Phosphatasen und Disampnasen – Enzyme, die hydrolytisch Phosphat- bzw. Ammoniumgruppen aus verschiedenen organischen Verbindungen entfernen.
4. Lyasen, Enzyme, die auf nicht-hydrolytische Weise bestimmte Gruppen von Substraten abspalten (z. B. CO2, HgO, SH2 usw.).
5. Isomerasen, die intramolekulare Umlagerungen im Substrat katalysieren.
6. Ligasen (Synthetasen) – eine Klasse von Enzymen, die die Addition zweier Moleküle aneinander unter gleichzeitigem Aufbrechen der Pprophosphatbindung in Triphosphaten katalysieren (z. B. Bildung von C-O-, C-N- oder C-S-Bindungen).

Saprophyten haben die höchste enzymatische Aktivität; in geringerem Maße kommt diese Eigenschaft bei pathogenen Bakterien zum Ausdruck. Die Untersuchung von Enzymen pathogener Bakterien ist äußerst wichtig, da anhand der Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Mikroben verschiedene Typen unterschieden und die Natur eines bestimmten Krankheitserregers bestimmt werden kann. Darüber hinaus bestimmt die enzymatische Aktivität von Mikroben die Pathogenese und das Krankheitsbild der Infektionskrankheit.
Enzyme werden in Exo- und Endoenzyme unterschieden. Exoenzyme werden von der Zelle an die äußere Umgebung abgegeben und führen den Abbau hochmolekularer organischer Verbindungen in einfachere Verbindungen durch, die zur Assimilation zur Verfügung stehen.
Bakterielle Enzyme werden in konstitutive und induzierbare Enzyme unterteilt. Die erste Gruppe umfasst jene Enzyme, die von der Bakterienzelle unabhängig vom Medium, auf dem das Bakterium gezüchtet wird, synthetisiert werden. Induzierbare Enzyme werden von diesem Bakterium nur als Reaktion auf die Wirkung eines spezifischen Induktors im Medium produziert.

Alle Stoffwechselreaktionen in einer Bakterienzelle basieren auf der Aktivität von Enzymen, die zu 6 Klassen gehören: Oxyreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Ligasen, Lyasen, Isomerasen. Von einer Bakterienzelle produzierte Enzyme können sowohl innerhalb der Zelle lokalisiert sein – Endoenzyme – als auch in die Umgebung freigesetzt werden – Exoenzyme. Exoenzyme spielen eine wichtige Rolle bei der Bereitstellung von Kohlenstoff- und Energiequellen für das Eindringen in die Bakterienzelle. Die meisten Hydrolasen sind Exoenzyme, die, wenn sie in die Umwelt freigesetzt werden, große Moleküle von Peptiden, Polysacchariden und Lipiden in Monomere und Dimere zerlegen, die in das Innere der Zelle eindringen können. Eine Reihe von Exoenzymen wie Hyaluronidase, Kollagenase und andere sind Aggressionsenzyme. Einige Enzyme sind im periplasmatischen Raum der Bakterienzelle lokalisiert. Sie sind an den Prozessen der Stoffübertragung in die Bakterienzelle beteiligt. Das Enzymspektrum ist ein taxonomisches Merkmal, das für eine Familie, eine Gattung und in manchen Fällen auch für eine Art charakteristisch ist. Daher dient die Bestimmung des Spektrums der enzymatischen Aktivität zur Bestimmung der taxonomischen Position von Bakterien. Das Vorhandensein von Exoenzymen kann mithilfe differenzialdiagnostischer Medien festgestellt werden. Zur Identifizierung von Bakterien wurden daher spezielle Testsysteme entwickelt, die aus einem Satz differenzialdiagnostischer Medien bestehen.

Identifizierung von Bakterien durch enzymatische Aktivität

Am häufigsten werden Enzyme der Klasse der Hydrolasen und Oxidoreduktasen mit speziellen Methoden und Medien bestimmt.

Zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität werden Mikroorganismen durch Injektion in eine Gelatinesäule eingeimpft. Nach 3–5 Tagen werden die Pflanzen untersucht und die Art der Gelatineverflüssigung festgestellt. Bei der Zersetzung von Protein durch einige Bakterien können bestimmte Produkte freigesetzt werden – Indol, Schwefelwasserstoff, Ammoniak. Zur Bestimmung werden spezielle Indikatorpapiere verwendet, die zwischen dem Hals und einem Wattestopfen in ein Reagenzglas mit MPB- und/oder Peptonwasser, das mit den zu untersuchenden Mikroorganismen beimpft ist, gelegt werden. Indol (ein Zersetzungsprodukt von Tryptophan) färbt einen mit einer gesättigten Oxalsäurelösung getränkten Papierstreifen rosa. Mit einer Bleiacetatlösung imprägniertes Papier wird in Gegenwart von Schwefelwasserstoff schwarz. Zur Bestimmung von Ammoniak wird rotes Lackmuspapier verwendet.

Ein taxonomisches Merkmal vieler Mikroorganismen ist die Fähigkeit, bestimmte Kohlenhydrate unter Bildung von Säuren und gasförmigen Produkten zu zersetzen. Um dies nachzuweisen, werden Hiss-Medien verwendet, die verschiedene Kohlenhydrate (Glukose, Saccharose, Maltose, Laktose usw.) enthalten. Um Säuren nachzuweisen, wird dem Medium Andredes Reagenz zugesetzt, das im pH-Bereich von 7,2 bis 6,5 seine Farbe von hellgelb nach rot ändert. Daher wird der Satz von Hiss-Medien mit dem Wachstum von Mikroorganismen als „bunte Reihe“ bezeichnet.

Um die Gasbildung zu erkennen, werden Schwimmer in flüssige Medien abgesenkt oder es werden halbflüssige Medien mit 0,5 % Agar verwendet.

Zur Bestimmung der für die Mischgärung charakteristischen intensiven Säurebildung wird der Methylrot-Indikator verwendet, der ab pH 4,5 gelb und bei niedrigeren pH-Werten rot ist.

Die Harnstoffhydrolyse wird durch die Freisetzung von Ammoniak (Lackmuspapier) und die Alkalisierung des Mediums bestimmt.

Bei der Identifizierung vieler Mikroorganismen wird die Voges-Proskauer-Reaktion auf Acetoin verwendet, eine Zwischenverbindung bei der Bildung von Butandiol aus Brenztraubensäure. Eine positive Reaktion weist auf das Vorliegen einer Butandiol-Fermentation hin.

Katalase kann durch Sauerstoffblasen nachgewiesen werden, die unmittelbar nach dem Mischen mikrobieller Zellen mit einer 1 %igen Wasserstoffperoxidlösung freigesetzt werden.

Zur Bestimmung der Cytochromoxidase werden folgende Reagenzien verwendet:

1) 1 % alkoholische Lösung von SS-Naphthol-1;

2) 1 %ige wässrige Lösung von N-Dimethyl-p-phenylendiamin-dihydrochlorid.

Das Vorhandensein von Cytochromoxidase wird anhand der blauen Farbe beurteilt, die nach 2–5 Minuten auftritt.

Zur Bestimmung von Nitriten wird das Griess-Reagenz verwendet: Das Erscheinen einer roten Farbe weist auf das Vorhandensein von Nitriten hin.

Enzymatische Eigenschaften von Bakterien

Zur Bestimmung der saccharolytischen Eigenschaften von Kohlenhydraten werden üblicherweise Laktose, Glucose, Maltose, Saccharose und Mannitol verwendet. Das Ergebnis der Reaktion wird anhand verschiedener dem Nährmedium zugesetzter Indikatoren ermittelt, die zu Farbreaktionen führen. Daher wird die Aussaat auf differenzialdiagnostischen Medien als Aussaat in einer bunten Reihe bezeichnet. Manchmal werden in der sogenannten langen bunten Reihe Arabinose, Xylose, Galactose, Inulin, Stärke usw. hinzugefügt.

Bei der Zersetzung von Kohlenhydraten entstehen organische Säuren (Milchsäure, Essigsäure, Ameisensäure) und Gase (CO2 und H2). Säuren bewirken eine pH-Änderung des Mediums, was durch die Indikatorreaktion zu einer Farbveränderung führt. Das entstehende Gas verdrängt die Flüssigkeit im oberen Teil des Schwimmers (bei Verwendung einer flüssigen bunten Serie) oder führt zum Platzen des Agars (bei Verwendung von halbflüssigen Zuckern).

Medien zur Bestimmung saccharolytischer Eigenschaften

Hiss-Medien bestehen aus Peptonwasser, 1 % Kohlenhydraten und Andrede-Indikator (saures Fuchsin, mit Alkali verfärbt). In das Medium wird ein Schwimmer abgesenkt, der bei der Sterilisation mit dem Medium gefüllt wird. Wenn Zucker durch Bakterien fermentiert wird, ändert sich die Farbe des Mediums in Rot und es sammelt sich Gas im Schwimmer an.

Halbflüssiger Zucker bestehen aus 0,7 % Fleischpepton-Agar, 1 % Zucker und einem pH-Indikator (wasserblauer Farbstoff und Rosolsäure). Die Aussaat erfolgt durch Injektion. Bei der Fermentation von Zucker verfärbt sich das Medium blau; kommt es bei der Aussaat zu Gasbildung, sind Gasblasen sichtbar und der Agar selbst platzt. In der Laborpraxis werden häufig auch andere zuckerhaltige Differentialdiagnosemedien eingesetzt.

Proteolytische Eigenschaften Bakterien (Proteinabbau) werden durch den Nachweis bestimmt Endprodukte der Proteinfermentation(Indol, Schwefelwasserstoff, Ammoniak) und die Fähigkeit, Gelatine zu verflüssigen (Fleischpeptonbrühe mit 10-15 % Gelatine).

Gelatine verflüssigen Mikroben, die ein Enzym absondern Kollagenase. Der Verflüssigungsprozess kommt von oben und verschiedene Arten von Mikroben verleihen ihnen eine charakteristische Form. Daher wird diese Eigenschaft auch zur Identifizierung von Bakterien genutzt.

Die Bestimmung der Proteinfermentation anhand der endgültigen Zersetzungsprodukte erfolgt bei Aussaat auf Fleisch-Pepton-Brühe oder Pepton-Wasser.

Somit verfügen wir nach Abschluss der Arbeit zur Isolierung einer Reinkultur über Daten zu den morphologischen, färberischen, kulturellen und biochemischen Eigenschaften der isolierten Bakterienkulturen. Dies gibt Anlass, mit der Artenidentifizierung fortzufahren – der Hauptaufgabe der letzten Stufe der bakteriologischen Forschung. Zu diesem Zweck wird die Bergi-Determinante verwendet. Dies ist eine Referenzpublikation, ein Katalog von Bakterien. Darin werden alle Mikroorganismen nach ihren grundlegenden biologischen Eigenschaften gruppiert. Durch den Vergleich der Eigenschaften der ausgewählten Kulturpflanzen mit den in der Determinante angegebenen Eigenschaften stellen sie deren Zugehörigkeit zu einer Gruppe, Familie, Gattung und schließlich Art fest.

Basierend auf Morphologie, Art der Atmung, färbenden Eigenschaften und der Fähigkeit zur Sporenbildung wird eine taxonomische Gruppe für die identifizierte Kultur gefunden. Basierend auf vollständigen morphologischen, färberischen Eigenschaften, Art der Atmung, Sporulation, kulturellen Eigenschaften und einigen biochemischen Merkmalen wird eine Familie gefunden; basierend auf methodischen Merkmalen (Vorhandensein von Kapseln, Flagellen usw.), kulturellen und biochemischen Merkmalen wird eine Gattung bestimmt und intern Jede Gattung wird durch ihre biochemischen und antigenen Eigenschaften bestimmt.

Selbstständige Arbeit des Studierenden

Während einer praktischen Unterrichtsstunde

Kontrollfragen

1. Ernährung von Bakterien: Autotrophe und Heterotrophe.

2. Klassifizierung von Nährmedien.

3. Bedingungen für die Kultivierung von Mikroben.

4. Anforderungen an Nährmedien.

5. Chemische Zusammensetzung von Mikroben.

6. Das Konzept der Reinkultur und Kolonien.

7. Methoden zur Isolierung reiner Kulturen aerober Mikroben.

8. Phasen der Isolierung einer Reinkultur aerober Bakterien.

9. Kulturelle Eigenschaften von Bakterien.

10. Biologische Oxidation in aeroben und anaeroben Bakterien.

11. Methoden zur Kultivierung von Anaerobiern.

12. Methoden zur Isolierung reiner Anaerobierkulturen.

13. Die Bedeutung von Enzymen bei der Identifizierung von Bakterien.

Thema: „Der Einfluss von Umweltfaktoren auf Mikroorganismen.“ Wirkung physikalischer und chemischer Faktoren. Sterilisation und Desinfektion“

Ziel:

– Methoden zum Sterilisieren von Laborglasgeräten erlernen und

Nährmedien

Aufgaben:

– in der Lage sein, die geeignete Sterilisationsmethode richtig auszuwählen

verschiedene Gegenstände (Umgebung, Geschirr, Werkzeuge usw.);

– Beherrschen Sie die Hauptgruppen der Desinfektionsmittel und die Wirkungsweise

ihre Wirkung auf Bakterien.

In der äußeren Umgebung werden Mikroben durch physikalische, chemische und biologische Faktoren beeinflusst, die ihre lebenswichtige Aktivität entweder hemmen oder stimulieren.

ZU physische Faktoren Dazu gehören: hohe und niedrige Temperaturen, Trocknung, Strahlungsenergie, Ultraschall, hoher Druck.

Temperatur. Die physiologische Aktivität eines jeden Mikroorganismus ist an ein bestimmtes Temperaturoptimum angepasst. In Bezug auf die Temperatur werden alle Mikroorganismen in unterteilt Psychophile(von 0 bis +10°С), Mesophile(von +20°С bis +40°С) und Thermophile(+50°С – +70°С). Die meisten pathogenen Mikroorganismen sind Mesophile.

Die meisten Mikroorganismen sind kälteresistent (Ausnahme sind Gonokokken und Meningokokken).

Enzymatische Aktivität von Bakterien

Hohe Temperaturen (+50°C – +60°C) wirken sich schädlich auf vegetative Bakterienformen aus. Die Sporen können dem Kochen bis zu 2 Stunden standhalten. Die zerstörerische Wirkung hoher Temperaturen ist die Grundlage der Sterilisationsmethoden.

Grundlegende Antiepidemiemaßnahmen

Im Labor

Sterilisation

Unter Sterilisation versteht man die Entfernung oder Zerstörung aller lebenden Mikroorganismen (vegetative und sporenartige Formen) im Inneren oder auf der Oberfläche von Gegenständen.

Die Sterilisation erfolgt mit verschiedenen Methoden: physikalisch, chemisch, mechanisch.

Die grundlegenden Anforderungen an den Sterilisationsprozess sind in der Industrienorm 42-21-2-82 „Sterilisation und Desinfektion von Medizinprodukten“ wiedergegeben. Methoden, Mittel, Regime.“

Physikalische Methoden

Die gebräuchlichste Sterilisationsmethode ist die Einwirkung hoher Temperaturen. Bei Temperaturen um die 100 °C sterben die meisten pathogenen Bakterien und Viren ab. Sporen thermophiler Bodenbakterien sterben, wenn sie 8,5 Stunden lang gekocht werden. Mikroorganismen, die in tiefen Erdschichten eingeschlossen oder mit geronnenem Blut bedeckt sind, werden vor hohen Temperaturen geschützt und behalten ihre Lebensfähigkeit.

Bei der Sterilisation mit physikalischen Methoden werden hohe Temperaturen, Druck, ultraviolette Strahlung usw. verwendet.

Die einfachste, aber zuverlässigste Art der Sterilisation — Kalzinierung. Es dient zur Oberflächensterilisation von nicht brennbaren und hitzebeständigen Gegenständen unmittelbar vor deren Verwendung.

Eine weitere einfache und leicht zugängliche Sterilisationsmethode ist Sieden. Dieser Vorgang wird in einem Sterilisator durchgeführt – einer rechteckigen Metallbox mit zwei Griffen und einem dicht schließenden Deckel. Im Inneren befindet sich ein herausnehmbares Metallgitter mit seitlichen Griffen, auf dem das zu sterilisierende Instrument abgelegt wird. Der Hauptnachteil der Methode besteht darin, dass sie keine Sporen zerstört, sondern nur vegetative Formen.

Bei der Dampfsterilisation müssen bestimmte Bedingungen erfüllt sein, die ihre Wirksamkeit und den Erhalt der Sterilität der Produkte für einen bestimmten Zeitraum gewährleisten. Die Sterilisation von Instrumenten, OP-Wäsche und Verbandmaterial sollte zunächst in der Verpackung erfolgen. Zu diesem Zweck werden verwendet: Sterilisationsboxen (Boxen), doppelte Weichverpackungen aus Kattun, Pergament, feuchtigkeitsbeständiges Papier (Kraftpapier), Polyethylen hoher Dichte.

Eine zwingende Anforderung an die Verpackung ist die Dichtheit. Der Zeitraum zur Aufrechterhaltung der Sterilität hängt von der Art der Verpackung ab und beträgt drei Tage für Produkte, die in Kartons ohne Filter, in doppelten Weichverpackungen aus Kattun und wasserbeständigen Papiertüten sterilisiert werden. In Sterilisationsboxen mit Filtern bleibt die Sterilität der Produkte das ganze Jahr über erhalten.

Sterilisation mit trockener Hitze

Der Twird in einem Trockenhitzeofen (in einem Pasteurofen usw.) durchgeführt – einem Metallschrank mit Doppelwänden. Der Schrankkorpus enthält eine Arbeitskammer mit Ablagen zum Ablegen der zu verarbeitenden Gegenstände sowie Heizelemente, die zur gleichmäßigen Erwärmung der Luft in der Arbeitskammer dienen.

Sterilisationsmodi:

Temperatur 150 °C – 2 Stunden;

Temperatur 160 °C – 170 °C – 45 Minuten – 1 Stunde;

Temperatur 180 °C – 30 Minuten;

Temperatur 200 °C – 10-15 Minuten.

Es ist zu beachten, dass Papier und Watte bei einer Temperatur von 160 °C gelb werden, bei höherer Temperatur verbrennen (karbonisieren). Der Beginn der Sterilisation ist der Moment, in dem die Temperatur im Ofen den gewünschten Wert erreicht. Nach Abschluss der Sterilisation wird der Ofen ausgeschaltet, das Gerät auf 50 °C abgekühlt und anschließend das Sterilgut entnommen.

Produkte in einem Luftsterilisator können ohne Verpackung sterilisiert werden, jedoch nur, wenn sie unmittelbar nach der Sterilisation verwendet werden. Als Verpackung kann Sackpapier nach GOST 2228-81 verwendet werden; darin können Produkte mindestens 3 Tage gelagert werden.

Der Luftsterilisationsmodus wird durch zwei Temperaturwerte dargestellt – 160 °C für 2,5 Stunden oder 180 °C für 1 Stunde.

Sterilisation mit fließendem Dampf

Diese Art der Sterilisation wird in einem Koch-Gerät oder in einem Autoklaven bei abgeschraubtem Deckel und geöffnetem Auslassventil durchgeführt. Der Koch-Apparat ist ein Metallhohlzylinder mit doppeltem Boden. Das zu sterilisierende Material wird nicht dicht in die Kammer des Geräts geladen, um einen maximalen Kontakt mit dem Dampf zu gewährleisten. Die anfängliche Erwärmung des Wassers im Gerät erfolgt innerhalb von 10-15 Minuten.

Mit strömendem Dampf werden Materialien sterilisiert, die sich bei Temperaturen über 100 °C zersetzen oder verderben – Nährmedien mit Kohlenhydraten, Vitaminen, Kohlenhydratlösungen usw.

Die Sterilisation mit fließendem Dampf erfolgt im fraktionierten Verfahren – bei einer Temperatur von nicht mehr als 100 °C für 20–30 Minuten über 3 Tage. In diesem Fall sterben die vegetativen Formen der Bakterien ab und die Sporen bleiben lebensfähig und keimen innerhalb von 24 Stunden bei Raumtemperatur. Das anschließende Erhitzen gewährleistet den Tod dieser vegetativen Zellen, die zwischen den Sterilisationsstufen aus Sporen hervorgehen.

Tyndalisierung– eine Methode der fraktionierten Sterilisation, bei der das Erhitzen des sterilisierten Materials bei einer Temperatur von 56–58 °C für eine Stunde an 5–6 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt wird.

Pasteurisierung– einmaliges Erhitzen des Materials auf 50–65 °C (für 15–30 Minuten), 70–80 °C (für 5–10 Minuten). Wird verwendet, um Nicht-Sporen-Mikroben in Lebensmitteln (Milch, Säfte, Wein, Bier) zu zerstören.

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