Последните от своя страна се делят на. Тънкослойна хроматография. Приложение във фармацията. Сравнение със свидетел

Въпреки това беше внедрена и газова версия на TLC. Като такива се използват финозърнест Al 2 O 3 и др., покрити със стъкло, фолио или плочи; за защита на слоя, използвайте или други. Индустрията произвежда готови записи с вече прикрепен слой. Елуентите обикновено са смеси от орг. разтвори, водни разтвори, комплексообразователи и др. В зависимост от избора на хроматограф системи (състав на подвижни и неподвижни фази) при разделянето на материята. процесите могат да играят роля. На практика няколко често се прилагат едновременно. разделителни механизми.

В зависимост от позицията на плаката и посоката на потока на елуента се различават възходяща, низходяща и хоризонтална ТСХ. Според техниката на работа се разграничават фронтален анализ (когато анализираната смес служи като подвижна фаза) и често използвана версия за елуиране. „Кръгова“ ТСХ (когато анализираният разтвор и разтворът се подават последователно към центъра на плаката) и „антикръгова“ ТСХ (когато анализираният разтвор се прилага в кръг и елуентът се движи от периферията към центъра на плоча), TLC под (когато -разтворител под преминава през слой, покрит с плътно притиснати), както и TLC при условия на градиент на температура, състав и др. В т.нар. двумерна тънкослойна хроматография процесът се извършва последователно в две взаимно перпендикулярни посоки с различни. елуенти, което повишава ефективността на разделяне. За същата цел се използват множество елуации в една посока.

Във версията за елуиране върху слоя се нанасят капки (1-5 µl в обем) от анализирания разтвор и ръбът на плочата се потапя в елуента, който се намира на дъното на херметически затворена стъклена камера. Елуентът се движи по протежение на слоя под действието на капилярни и гравитационни сили; анализираната смес се движи в същата посока. В резултат на многократно повторение и в съответствие с коеф. разпределения в избрания се отделят и подреждат върху чинията в отделни зони.

След завършване на процеса плочата се изважда от камерата, подсушава се и отделените зони се детектират според тях. боядисване или след напръскване с разтвори, които образуват цветни или флуоресцентни петнас компонентите на сместа, които трябва да се разделят. Радиоактивните вещества се откриват авторадиографски (чрез облъчване на плака, наложена върху нея). Също така се използва. и активни методи за откриване. Получената картина на разпределението на хроматограф зони нар хроматограма (вижте фигурата).

Хроматограма, получена чрез разделяне на смес от три компонента по метода на тънкия слой.

Хроматографска позиция зоните в хроматограмата се характеризират със стойността R f - отношението на пътя l i, изминат от центъра на зоната на i-тия компонент от началната линия до пътя l, изминат от елуента: R f = l i /l ; R f 1. Стойността на R f зависи от коеф. разпределение () и съотношението на обемите на подвижната и неподвижната фази.

Разделянето при TLC се влияе от редица фактори - състава и свойствата на елуента, естеството, температурата, размера и дебелината на слоя и размерите на камерата. Следователно, за да се получат възпроизводими резултати, е необходимо внимателно да се стандартизират експерименталните условия. Съответствието с това изискване ви позволява да зададете R f с относителна. стандартно отклонение 0,03. При стандартни условия R f е константа за даден елемент и се използва за последния.

Количество на компонента в хроматографията Зоната се определя директно върху слоя от площта на зоната (обикновено диаметърът му варира от 3 до 10 mm) или интензитета на цвета му (). Използват и автоматични. сканиращи инструменти, които измерват абсорбцията, пропускането или отразяването на светлината, или хроматография. зони Отделените зони могат да бъдат изстъргани от плочата заедно със слоя, компонентът може да бъде извлечен в разтвор и разтворът може да бъде анализиран с помощта на подходящ метод (луминесценция, атомна абсорбция, атомна флуоресценция, радиометричен анализ и др.). Грешката в количественото определяне обикновено е 5-10%; граници на откриване на вещества в зоните -10 -3 -10 -2 μg (използвайки цветни производни) и 10 -10 -10 -9 μg (използвайки ).

Предимства на TLC: простота, рентабилност, наличие на оборудване, бързина (продължителност на разделянето 10-100 минути), висока производителност и ефективност на разделянето, яснота на резултатите от разделянето, лекота на хроматографско откриване. зони

TLC се използва за разделяне и анализ на органични и неорг. в-в: почти всички не-орг.

-> Добавете материали към сайта -> Аналитична химия -> Золотов Ю.А. -> "Основи на аналитичната химия, том 2" ->

Основи на аналитичната химия, том 2 - Золотов Ю.А.

Золотов Ю.А., Дорохова Б.Н., Фадеева В.И. Основи на аналитичната химия, том 2 - М.: Висше училище, 1996. - 461 с.
ISBN 5-06-002716-3
Изтегли(пряка връзка) : osnovianalhimt21996.djvu Предишна 1 .. 164 > .. >> Следваща
Степанов А.Б., Корчемная Е.К. Електромиграционен метод в неорганичния анализ. - М.: Химия, 1979.
Hwang S, Kammermeier K. Процеси на разделяне на мембраната. - М.: Химия, 1981.
глава 8
Aivaeov B.V. Основи на газовата хроматография. - М.: Висше училище, 1977. Белявская Т.А., Болшова Т.А., Брикина Г.Д. Хроматография на неорганични вещества. - М.: Висше училище, 1986.
447
Березкин В.Г., Бочков А.С. Количествена тънкослойна хроматография.
- М.: Наука, 1980.
Количествен анализ чрез хроматографски методи / Ed. Е. Кац.
- М.: Мир, 1990.
Perry S, Amos R, Brewer P. Практическо ръководство за течна хроматография. - М.: Мир, 1974.
Styskin E.L., Itsikson L.B., Braude E.V. Практическа високоефективна течна хроматография. - М.: Химия, 1986.
Шац В.Д., Сахартова О.В. Високоефективна Течна хроматография. - Рига: Zinatne, 1988.
Шпигун О.А., Золотов Ю.А. Йонна хроматография и нейното приложение при анализ на вода. - М.: Издателство на Московския държавен университет, 1990 г.
Engelhardt T.H. Течна хроматография при високо налягане. - М.: Мир, 1980.
Глава 9
Дятлова Н.М., Темкина В.Я., Попов К.И. Комплексони и метални комплексонати. - М.: Химия, 1988.
Индикатори/Ред. П. епископ. T. i и 2., - М.: Мир, 1976.
Przybil R. Аналитични приложения на етилендиаминтетраоцетна киселина и свързани съединения. - М.: Мир, 1975.
Титриметрични методи за анализ на неводни разтвори/Изд. В.Д. Безугли. - М.: Химия, 1986.
Ашуърт M.R.F. Титриметрични методи за анализ на органични съединения. Методи на директно титруване. - М.: Химия, 1968.
Глава 10
Бонд А.М. Полярографски методи в аналитичната химия. - М.: Химия, 1983.
Корита И. Йони, електроди, мембрани. - М.: Мир, 1983.
Майрановски С.Г., Страдин Я.П., Безуглий В.П. Полярография в органичната химия. - М.: Химия, 1975.
Николски Б.П., Матерова Е.А. Йоноселективни електроди. - Л.: Химия, 1980.
Plambeck J. Електрохимични методи за анализ. Основна теория и приложение. - М.: Мир, 1985.
Справочно ръководство за прилагане на йон селективни електроди. - М.: Мир, 1986. 448
Глава 11
Бенуел К. Основи на молекулярната спектроскопия. - М.: Мир, 1985. Britske M.E. Атомно-абсорбционен спектрохимичен анализ. - М.: Химия, 1982.
Вилков Л.В., Пентин Ю.А. Физически методи на изследване в химията. Резонансни и електрооптични методи. - М.: Висше училище, 1989.
Вилков Л.В., Пентин Ю.А. Физически методи на изследване в химията. Структурни методи и оптична спектроскопия. - М.: Висше училище, 1987.
Demtroeder V. Лазерна спектроскопия. - М.: Наука, 1985.
Zaydel A.N. Атомен флуоресцентен анализ. Физическа основа на метода.
- М.: Наука, 1980.
Йонин B.I., Ершов B.A., Колцов A.I. ЯМР спектроскопия в органичната химия. - Л.: Химия, 1983.
Кузнецова Л.А., Кузменко Н.Е., Кузяков Ю.Я., Пластинин Ю.А. Вероятности за оптични преходи на двуатомни молекули. - М.: Наука, 1980.
Кузяков Ю.Я., Семененко К.А., Зоров Н.Б. Методи за спектрален анализ.
- М.: Издателство на Московския държавен университет, 1990 г.
Пешкова В.М., Громова М.И. Методи на абсорбционна спектроскопия в аналитичната химия. - М.: Висше училище, 1976.
Цена V. Аналитична атомно-абсорбционна спектроскопия. - М.: Мир, 1976.
Свръхчувствителна лазерна спектроскопия/Изд. Д. Клигер.
- М.: Мир, 1986.

Терек Т., Мика Дж., Гегуш Е. Емисионен спектрален анализ. Т. 1 и 2.
- М.: Мир, 1982.
Томпсън М., Уолш Д.Н. Ръководство за спектрометричен анализ на индуктивно свързана плазма. - М.: Недра, 1988.
Чудинов Е. Г. Атомно-емисионен анализ с индукционна плазма.//Итоги науки и техники. - М.: ВИНИТИ. 1990 г.
Глава 12
Полякова А.А. Молекулярно-масов спектрален анализ на органични съединения. - М.: Химия, 1983.
Спектроскопски методи за определяне на микроелементи / Ed. J. Winefordner. - М.: Мир, 1979.
Сисоев А.А., Чупахин М.С. Въведение в масспектрометрията. - М.: Атом-издат, 1977.
449
Глава 13
Кузнецов Р.А. Анализ на активирането. - М.: Атомиздат, 1974. Нови методи на радиоаналитичната химия / Изд. Г.Н. Билимович и М. Кирша. - М.: Енергия, 1982.
Глава 14
Павлова С.А., Журавлева И.В., Толчински Ю.И. Термичен анализ на органични и високомолекулни съединения. - М.: Химия, 1983.
Топор Н.Д., Огородова Л.П., Мелчакова Л.В. Термичен анализ на минерали и неорганични съединения. - М.: Издателство на Московския държавен университет, 1987 г.
Wendlandt U. Термични методи за анализ. - М.: Мир, 1978.
Шестак Я. Теория на термичния анализ. Физикохимични свойства на твърдите неорганични вещества. - М.: Мир, 1987.
Глава 15
Баркър Ф. Компютри в аналитичната химия. - М.: Мир, 1987.
Джонсън К. Д. Числени методи в химията. - М.: Мир, 1983.
Jure P., Eienauer T. Разпознаване на образи в химията: - М.: Мир, 1977.
Математически методи и компютри в аналитичната химия/Изд. Ел Ей Грибова. - М.: Наука, 1989.
Teach G. Персонални компютри за учени. - М.: Мир, 1990.
Forsyth D., Malcolm M., Mowler K. Машинни методи за математически изчисления. - М.: Мир, 1980. MZRF

DVSMU

Катедра по обща, физична и колоидна химия

Есе

Тънкослойна хроматография. Приложение във фармацията

Изпълнил: студент от група 201-F

Данилов Д. И.

Проверен от: Немов В. А.

Хабаровск, 2005

ПЛАН:

Въведение

Физикохимични основи на ТСХ

Разделителна хроматография върху хартия

Основи на тънкослойната хроматография

• сорбенти
• разтворители
• подготовка на плочата
• техника за прилагане на тестови решения

Хроматография

Изсушаване на плочите.

Идентифициране на отделени вещества

Приложение на метода ТСХ във фармацията

• Количествено определяне на тритерпенови сапонини чрез HPTLC с използване на сканираща денситометрия
• Изследване на липидния и флавоноидния състав на проби от някои видове от род Chin (Lathyrus.)

Заключение

Литература

Въведение

Тънкослойна хроматография (TLC, TLC) е един от най-използваните методи за хроматографски анализ, но най-малко популярен.
Въпреки значителните недостатъци, които съществуваха доскоро, той се използва широко за качествен анализ на смеси, главно поради ниската си цена и скоростта на получаване на резултатите. Тънкослойната хроматография (TLC) първоначално е разработена за разделяне на липиди. Въпреки че хартиената хроматография е по-бърза от колонната хроматография, нейният недостатък е, че хартията може да бъде направена само от материали на основата на целулоза, което я прави неподходяща за разделяне на неполярни вещества. Тънкослойната хроматография запазва всички предимства на хартиената хроматография, но позволява използването на всеки материал, който може да бъде фино смлян и след това да образува хомогенен слой. Това могат да бъдат неорганични вещества като силикагел, двуалуминиев оксид, диатомит и магнезиев силикат, както и органични вещества като целулоза, полиамиди и полиетилен на прах.

Физико-химични основи на тънкослойната хроматография.

Основата на тънкослойната хроматография е методът на адсорбция, въпреки че се използва и разделителна хроматография.
Адсорбционният метод се основава на разликата в степента на сорбция-десорбция на отделените компоненти върху неподвижната фаза. Адсорбцията се извършва благодарение на силите на Ван дер Валс, които са в основата на физическата адсорбция, полимолекулярна (образуване на няколко слоя адсорбат върху повърхността на адсорбента) и хемосорбция (химическо взаимодействие на адсорбента и адсорбата).
Ефективните процеси на сорбция-десорбция изискват голяма площ, което поставя определени изисквания към адсорбента. При голяма повърхност на разделяне на фазите бързо се установява равновесие между фазите на компонентите на сместа и се получава ефективно разделяне.
Друг тип, използван в метода на тънкослойна хроматография, е разделителната течна хроматография.
При разделителната хроматография и двете фази - подвижна и неподвижна - са течности, които не се смесват помежду си. Разделянето на веществата се основава на разликата в техните коефициенти на разпределение между тези фази.
За първи път методът на тънкослойна хроматография се обяви като „хартиена тънкослойна хроматография“, която се основава на разпределителния метод на разделяне на компонентите.

Разделителна хроматография върху хартия.

Поради факта, че хроматографската хартия, използвана при този метод (специални сортове филтърна хартия), съдържа вода (20-22%) в порите, като друга фаза се използват органични разтворители.
Използването на хроматография върху хартия има редица съществени недостатъци: зависимостта на процеса на разделяне от състава и свойствата на хартията, промени във водното съдържание в порите на хартията при промяна на условията на съхранение, много ниска скорост на хроматография ( до няколко дни) и ниска възпроизводимост на резултатите. Тези недостатъци сериозно засягат разпространението на хартиената хроматография като хроматографски метод.
Следователно появата на хроматография в тънък слой сорбент - тънкослойна хроматография - може да се счита за естествена.

Основи на тънкослойната хроматография.

При метода TLC хроматографията на веществата се извършва в тънък слой сорбент, нанесен върху твърда плоска основа. Разделянето при този метод се основава главно на сорбция-десорбция.
Използването на различни сорбенти направи възможно значително разширяване и подобряване на този метод.
В началото на метода плочите трябваше да бъдат направени самостоятелно. Но днес се използват предимно фабрично произведени плочи, които имат доста широка гама от размери, медии и субстрати.
Модерната хроматографска плака е направена от стъкло, алуминий или полимер (например политерефталат). Поради факта, че стъклената основа става все по-малко популярна (често се чупи, невъзможно е плочата да се раздели на няколко части, без да се повреди сорбентният слой, има голямо тегло), най-широко използваните плочи са тези с алуминиево фолио или полимери като основи.
За фиксиране на сорбента се използват гипс, нишесте, силициев зол и др., които задържат зърната на сорбента върху субстрата. Дебелината на слоя може да бъде различна (100 или повече микрона), но най-важният критерий е слоят да е еднакъв по дебелина навсякъде върху хроматографската плака.

сорбенти

Най-разпространеният сорбент е силикагелът.
Силикагелът е хидратирана силициева киселина, образувана от действието на минерални киселини върху натриев силикат и изсушаване на получения зол. След смилането на зола се използва фракция с определен размер на зърното (посочен на плочата, обикновено 5-20 микрона).
Силикагелът е полярен сорбент, в който -OH групите служат като активни центрове. Лесно адсорбира вода на повърхността и образува водородни връзки.
Алуминий. Алуминиевият оксид е слабо основен адсорбент и се използва предимно за разделяне на слабо основни и неутрални съединения. Недостатъкът на плочите от алуминиев оксид е задължителното активиране на повърхността преди употреба в пещ при високи температури (100-150 0 C) и ниската адсорбционна способност на слоя в сравнение със силикагела.
Диатомичната пръст е адсорбент, получен от естествени минерали: диатомична пръст. Сорбентът има хидрофилни свойства, но по-нисък адсорбционен капацитет на слоя в сравнение със силикагела.
Магнезиевият силикат е по-малко полярен от силикагела и обикновено се използва в случаите, когато по-полярните адсорбенти не осигуряват ефективно разделяне.
Целулоза – тънкослойните плочи, покрити с целулоза, са много ефективни при разделянето на сложни органични молекули. Адсорбентът се състои основно от целулозни перли с диаметър до 50 микрона, фиксирани към носител с нишесте. Но както при хартиената хроматография, издигането на фронта на разтворителя става много бавно.
В йонообменни хроматографски плаки като адсорбент се използват йонообменни смоли, съдържащи кватернерни амониеви или активни сулфо групи, участващи в йонообмен. Тънкослойна хроматография с този тип плаки се извършва с подвижни фази, съдържащи силни киселини или основи. Тези плочи са ефективни за разделяне на високомолекулни и амфотерни съединения.

Горните сорбенти са най-често срещаните, но в допълнение към тях има много вещества, използвани като сорбенти. Това са талк, калциев сулфат, нишесте и др.
В същото време дори вече споменатите сорбенти могат да бъдат модифицирани, за да им се придадат нови сорбционни свойства (импрегниране на сорбенти с реагенти, например AgNO 3, създаване на плочи с обърната фаза). Именно това разнообразие от възможни фази при минимални разходи прави възможно използването на TLC за хроматография на огромен брой вещества.

Разтворители

При тънкослойна хроматография като подвижна фаза се използват или чисти вещества (етилацетат, бензен и др.), или смеси от вещества (системи) в определено съотношение.
Изборът на мобилна фаза (система) се извършва съгласно следните правила:

· Изберете система, в която отделените компоненти имат ниска разтворимост (ако разтворимостта на веществото е висока, тогава веществата ще се движат с фронта, ако разтворимостта е ниска, те ще останат в началото). Когато се използва разделителна хроматография или когато се използват обратни фази, разтворимостта на веществата трябва да бъде по-висока в подвижната фаза, отколкото в неподвижната фаза.

· Съставът на системата трябва да бъде постоянен и лесно възпроизводим.

· Разтворителят или компонентите на системата не трябва да са токсични или с дефицит.

· Системата трябва напълно да разделя вещества с подобна структура, а разликите в Rf трябва да са поне 0,05.

· Системата не трябва да причинява химически промени в отделените компоненти.

· В избраната система аналитите трябва да имат различни Rf стойности и да бъдат разпределени по цялата дължина на хроматограмата. Желателно е стойностите на Rf да са в диапазона от 0,05-0,85.

· При избора на система е необходимо да се вземе предвид и естеството на отделяните вещества. По този начин, когато хроматографирате вещества с основни свойства, системата не трябва да има киселинни свойства и обратно.

Подготовка на чинии

Когато използвате закупени плаки, те трябва първо да бъдат подготвени за хроматография. Това се дължи на факта, че пластинчатите адсорбенти по време на съхранение абсорбират не само влагата, но и други вещества, съдържащи се във въздуха. Когато се използват неподготвени плаки по време на хроматографския процес, се появява фронт на „мръсотия“, който може да попречи на определянето на вещества с големи стойности на Rf, а някои вещества, като вода, могат да променят състава на подвижната фаза, като по този начин променят получената Rf стойности.
Предварителната подготовка на плочите се състои в намазване на плочите с чист разтворител по цялата височина на плочата (метанол, бензен, диетилов етер), последвано от сушене на плочите в пещ при температура 110-120 0C за 0,5-1 час. По този начин могат да се приготвят няколко плочи наведнъж и при съхранение на сухо и затворено място запазват свойствата си няколко месеца.

Техника за прилагане на изследваните решения.

Както се оказва, прилагането на тестваното вещество не е толкова сложна операция, но в същото време значително влияе върху получените резултати от хроматографията.
Често се изследват или течни аналити, или разтвори на твърди вещества, без предварителна подготовка на пробите.
Следователно винаги е необходимо да запомните няколко точки, които сериозно влияят на резултатите от разделянето.
Най-важна е концентрацията на прилаганите вещества. В TLC е обичайно да се прилагат концентрации на разтвора от около 1%. Но от друга страна, чувствителността на метода позволява да се определят вещества с много по-ниски концентрации.
Ако общата концентрация на компонентите в тестваното вещество е неизвестна или концентрацията е известна, но този тип вещество все още не е хроматографирано, е необходимо да се определи колко от тестовия разтвор е достатъчен за висококачествена хроматография. Има няколко техники за определяне на това.
Първо трябва да нанесете няколко еднакви по големина, но с различни количества (например 1, 2, 5 μl) петна от хроматографираните разтвори и след хроматографиране да изследвате формата и размера на отделените петна.
Така че, с правилната концентрация, формата на отделените вещества е същата като формата, приложена върху стартовата линия. Ако отделените петна са по-големи от началното петно, тогава приложената концентрация е твърде висока. Появата на „опашки” и неправилната форма на отделящите се петна върху плочата също могат да показват висока концентрация, но могат да бъдат причинени от неправилно избрана хроматографска система или от химичното взаимодействие на отделените компоненти.
Чрез избор на количеството на прилаганото вещество и системата от разтворители е възможно да се постигне пълно разделяне на до десет компонента в изследваните вещества на една плоча. Удобно е да се прилагат проби върху специална маса с шаблони и отопление. Петната се нанасят върху “стартовата линия” на 1-2 см от долния ръб на чинията. Това е необходимо, така че когато плочата се спусне в системата, пробите не се разтварят в нея и цялото приложено вещество се подлага на хроматография.
Приложението на разтворите се извършва или с микроспринцовка, или с градуирани капиляри. Размерът на нанесеното петно ​​не трябва да надвишава 4 мм. Това се дължи на факта, че при по-голям размер на петното се получава промяна във формата под въздействието на физически сили и границите на отделените компоненти могат да се припокриват.
Прилагането на изпитваните вещества върху плочите не трябва да бъде придружено от разрушаване на сорбента (което значително влияе върху качеството на разделяне), следователно капката трябва да се нанесе чрез докосване на иглата или капиляра до слоя сорбент, а не чрез натискане. Размерът на полученото петно ​​се влияе не само от количеството приложен разтвор, но и от полярността на разтворителя и неговата точка на кипене. Така че, когато се прилага едно и също вещество в различни разтворители, полученото петно, в което е използван метанол като разтворител, ще бъде по-голямо от петното от разтвор на хлороформ. от друга страна, когато субстратът се нагрее, изпарението на разтворителите ще бъде по-интензивно и размерът на петното също ще намалее.
Разбира се, по-лесно е да използвате сешоар за изсушаване на петна при нанасяне, но само ако има пълна увереност, че нанесените вещества няма да се окислят под въздействието на горещ въздух.
Разстоянието между нанесените петна трябва да бъде около 2 см.
Понякога по време на хроматография върху плаки се наблюдава ефект на ръба, в резултат на което петната не са разположени на една и съща линия, а имат формата на подкова или диагонално. За да се елиминира този ефект, всяко петно ​​може да бъде „оборудвано“ със собствена писта, отделяща нанесената проба от останалите чрез премахване на линията на сорбента. Това се прави най-добре под линийка с остър предмет (като скалпел), но внимавайте да не отстраните твърде много сорбент.
След нанасяне на изпитваните вещества върху плаката е необходимо да се осигури пълно отстраняване на разтворителите, тъй като дори малко съдържание на разтворител в изпитваното вещество може да повлияе на разделянето и дори да промени състава на хроматографската система.
Отстраняването на разтворителите обикновено се извършва чрез естествено изсушаване на плочите за 5-10 минути или чрез нагряване със сешоар или във фурна.

Хроматография

Тънкослойната хроматография има няколко метода, свързани главно с типа движение на разтворителите.

Възходяща тънкослойна хроматография

Низходяща тънкослойна хроматография

Хоризонтална тънкослойна хроматография

· Радиална тънкослойна хроматография.

Възходяща тънкослойна хроматография

Този тип хроматография е най-често срещаният и се основава на факта, че предната част на хроматографската система се издига по протежение на плочата под действието на капилярни сили, т.е. предната част на хроматографската система се движи отдолу нагоре. За този метод се използва най-простото оборудване, тъй като всеки контейнер с плоско дъно и плътно прилягащ капак, който може свободно да се побере в хроматографска плака, може да се използва като хроматографска камера.
Методът на възходяща тънкослойна хроматография има редица недостатъци. Например, скоростта, с която фронтът се издига по протежение на плочата, се случва неравномерно, т.е. в долната част е най-висока, а с издигане на фронта намалява. Това се дължи на факта, че в горната част на камерата насищането на парите на разтворителя е по-малко, така че разтворителят от хроматографската плака се изпарява по-интензивно, поради което концентрацията му намалява и скоростта на движение се забавя. За да се елиминира този недостатък, към стените на хроматографската камера са прикрепени ленти от филтърна хартия, по които издигащата се хроматографска система насища камерата с пари в целия й обем.
Някои хроматографски камери са разделени на две тави в долната част. Това подобрение позволява не само да се намали консумацията на хроматографската система (необходим е по-малък обем, за да се получи необходимата височина на хроматографската система), но и да се използва допълнителна кювета за разтворител, който повишава налягането на наситените пари в камерата.
Друг недостатък е необходимостта да се наблюдава фронта на разтворителя, тъй като предната линия на разтворителя може да „избяга“ към горния ръб. В този случай вече не е възможно да се определи действителната стойност на Rf.

Низходяща тънкослойна хроматография

Този хроматографски метод се основава на факта, че предната част на хроматографската система се спуска по протежение на плочата главно под въздействието на гравитацията, т.е. предната част на подвижната фаза се движи отгоре надолу.
За този метод към горната част на хроматографската камера е прикрепена кювета с хроматографска система, от която се подава разтворител към хроматографската плака с помощта на фитил, който се стича надолу и пробата за изпитване се хроматографира.
Недостатъците на този метод включват сложността на оборудването. Този метод се използва главно в хартиената хроматография.

Хоризонтална тънкослойна хроматография

Този метод е най-сложен от гледна точка на хардуера, но най-удобен. Така в хроматографската камера плочата се поставя хоризонтално и системата се подава към единия край на плочата с помощта на фитил. Фронтът на разтворителя се движи в обратна посока.
Има още един трик, който ви позволява изключително да опростите камерата. За да направите това, хроматографска плака върху алуминиева основа е леко огъната и поставена в камерата. В този случай системата ще получава входни данни от двете страни едновременно. За тази цел са подходящи само плочи с алуминиева подложка, тъй като основата от пластмаса и стъкло е „неогъваема“, т.е. не запазва формата си.
Предимствата на този метод включват факта, че в хоризонтална кювета системата се насища с пари много по-бързо, скоростта на фронта е постоянна. И когато хроматографията се извършва от двете страни, предната част не „бяга“

Радиална тънкослойна хроматография.

Радиалната тънкослойна хроматография се състои от нанасяне на изпитваното вещество в центъра на плаката и добавяне на система, която се движи от центъра към ръба на плаката.

Изсушаване на плочите.

След процеса на разделяне на изследваните вещества плочите се изсушават. Това също е важен процес, тъй като дори да има следи от разтворител върху плаката, е възможно да се получат неправилни хроматографски резултати.
Ако хроматографската система съдържа само нискокипящи компоненти, тогава естественото сушене за 3-5 минути е достатъчно. Ако системата съдържа висококипящи течности (алкохоли, вода, органични киселини и др.), плочите трябва да се изсушат най-малко 10 минути или плочата трябва да се постави в сушилен шкаф.

Идентифициране на отделени вещества.

Изсушената плоча е хроматограма на изследваните вещества. Ако веществата са оцветени, тогава идентификацията започва с определяне на цвета на отделените вещества.
Но в повечето случаи веществата, които се разделят, са безцветни и просто визуално сравнение е невъзможно.
За тънкослойна хроматография има няколко вида качествен анализ (идентификация) на отделените вещества:

· Визуални методи и определяне на Rf на отделените вещества.

· Цветни реакции.

· Сравнение със свидетели.

· Физико-химични методи за идентификация.

Нека разгледаме по-подробно всеки тип качествен анализ в тънкослойната хроматография.

Физически методи

Визуалните методи се използват главно за определяне на местоположението на петна от отделени вещества върху хроматографска плака. За да направите това, плаката се изследва както във видима светлина, така и с ултравиолетова светлина (главно светлина с дължина на вълната 366 и 254 nm)
Това е първият етап на идентификация, при който се определя качеството на избраните условия и получените хроматографски резултати.
По този начин, след като се определи качеството на хроматографията (отсъствието на "опашки" на отделените вещества или припокриването на техните петна, правилната форма и размер, липсата на сливане на хроматографски следи и т.н.) и разделянето се признава за подходящи за по-нататъшни изследвания, се определя Rf на идентифицираните петна.

Rf стойност.

Един от основните индикатори в TLC е индикаторът Rf. Този параметър е аналог на времето на задържане и зависи както от свойствата на отделяните вещества, състава на подвижната фаза и сорбента, така и от физичните параметри.
Стойността на Rf се определя като съотношението на разстоянието, изминато от веществото, към разстоянието, изминато от фронта на разтворителя

Стойността на Rf е безразмерна величина и има стойност от 0 до 1. В литературата обаче често се срещат показатели като hRf, Rf×100, които са същите Rf, но умножени по 100, за да не оперират с десетични стойности.
Стойността на Rf не се влияе от разстоянието, изминато от фронта на разтворителя, но много методи описват преминаването на фронта на разстояние от 10 см. Това се използва само за улесняване на изчисленията на Rf.
На практика в началото се определя разстоянието, изминато от фронта на разтворителя: от началната линия (а не от ръба на плаката) до мястото, където е бил фронтът в края на хроматографията. След това се определя разстоянието от стартовата линия до мястото на отделеното вещество. Тук размерът на петното играе роля! В края на краищата, ако петното е с кръгла форма и малък размер, тогава получената Rf има ясна стойност. И ако полученото петно ​​е голямо или с неправилна форма, тогава при определяне на Rf на такова петно ​​грешката може да достигне 0,1!
В случай на разделителна хроматография, коефициентът на разпределение на дадено вещество и неговият Rf е свързан със съотношението:

Където SpИ Сн- площи на напречните сечения на подвижната и неподвижната фази.
Както виждаме, коефициентът на разпределение, с постоянно съотношение Sp/Snе количество, пропорционално зависимо от Rf и може да се определи чрез него.

Цветни реакции.

Цветните реакции в тънкослойната хроматография се използват изключително широко. Те служат не само за определяне на местоположението на отделените компоненти (третиране със сярна киселина, йодни пари), но и за определяне както на класа на веществата, така и за идентификация (при наличие на индивидуални реакции).
Тук няма да разглеждаме това огромно разнообразие от цветни качествени реакции; само ще кажем, че ако всички качествени реакции съвпадат и получените Rf стойности на веществото съвпадат в три различни системи с литературни данни, веществото се идентифицира. Въпреки че според мен е необходимо допълнително потвърждение чрез изследване с друг физико-химичен метод.

Сравнение със свидетел.

При провеждане на изследвания на вещества с очаквания състав, методът на хроматография с свидетел- известно вещество. Този метод се използва, когато е трудно да се издържат условия на хроматография, няма литературни данни за Rf за тази система или адсорбент, използването на градиентен метод и др. И когато извършвате цветни реакции, можете да сравните не само цветовете, но и нюансите на изследваните вещества и свидетели, което също е важно.
От друга страна, този метод изисква допълнителни разходи за свидетели.

Методи за количествен анализ

Количественият анализ в тънкослойната хроматография има няколко вида, характеризиращи всеки етап от развитието на метода. Въпреки че някои методи могат да се използват само полуколичествено, те все още се използват на практика.

Метод на визуално сравнение.Както бе споменато по-горе, интензитетът на цвета на петното и неговият размер зависят от количеството на хроматографираното вещество. Следователно визуалното количествено определяне се основава на няколко техники.
Метод на разреждане. Този метод се състои в определяне за всяко вещество на граничната концентрация, при която веществото не може да бъде определено чрез хроматографския метод. При хроматография изпитваното вещество се разрежда, докато спре да се появява върху плаката.
Съдържанието на вещество С, определено по този метод, се намира по формулата:

Където н-разреждане, А- концентрацията на веществото, при която то не се появява по време на хроматографията.
Метод за определяне на площта на петна.Ако се прилагат равни обеми от изпитвани вещества и свидетели, тогава получените площи на петна след хроматография са пропорционални на логаритъма на концентрацията на веществото. S= а вътре c+b

където a и b са емпирични коефициенти, определени експериментално.
Ако петното на отделеното вещество има остри граници, тогава площта на петното може да се определи по гравиметричен метод (изрежете петното и го претеглете), измерено с планиметър. Този метод дава грешка до 10-15%.
Въпреки това, той има редица съществени недостатъци. Първото и най-важно е, че по този начин е възможно да се определи концентрацията на вещества, които са оцветени или имат флуоресценция в UV областта (254, 366 nm). Този недостатък може да бъде отстранен чрез добавяне на различни фосфори към сорбента, което увеличава грешката при определяне.
Може да се използва и третиране на плаки с проявяващи се вещества (реагенти) (например използване на филтърна хартия, напоена с проявяващ реагент, последвано от контакт с хроматографска плака и по-нататъшно определяне на площта на разработеното вещество върху нея) , но грешката при определяне също е висока.
Необходимостта от по-надежден резултат от количественото определяне доведе до използването на инструментални методи.
Метод на елуиране. Този метод се състои в това, че отделеното вещество се отмива от сорбента с разтворител и концентрацията му се определя с други методи - фотометрични, полярографски и др. Това е доста точен метод, но само ако отделеното вещество е количествено изолирано. Поради високата си трудоемкост, методът се използва доста рядко и е неприемлив, когато има голям брой изследвани проби.
Фотографски методопределянето се състои от фотографиране на плаки с отделеното вещество и по-нататъшно определяне на степента на почерняване с помощта на дезинметри.
Радиографски методподобно на фотометричното, с единствената разлика, че се определя почерняването на плочата, причинено от излъчването на отделеното вещество. Този метод се използва само при определяне на вещества с белязани атоми.
Фотодезинтометричен методможе да се използва без изолиране на веществото от плочата и се основава на определяне не само на площта на петното, но и на неговия интензитет.
Това е най-точният метод за определяне на концентрацията на веществата, тъй като позволява, когато се използват калибрационни графики, да се извършват доста точни количествени определяния на всички отделени вещества (до 2-10%) директно върху плаката за кратък период от време. време.
Не е изненадващо, че с развитието на тънкослойната хроматография се увеличава използването на дезинметри, чувствителността и следователно точността на определяне на концентрацията на отделените вещества се увеличава и се доближава до точността на високоефективната течна хроматография.

Ориз. 1. Типична камера за проявяване на хроматографска плака с тънък слой

1. капак
2. стъклена камера
3. TLC плака
4. сорбент
5. примерен сайт за кандидатстване
6. разтворител

Типична TLC хроматограма на метилови естери на мастни киселини.

На хроматограмата СЛАВА= метилови естери на мастни киселини = метилови естери на мастни киселини. Започнете= точка на приложение на смесите за разделяне.

Хроматограмата се извършва върху плоча Sorbfil. Система - бензен. Проява - овъгляване след пръскане със сярна киселина.

Точка 1 - метилови естери на мастни киселини. Точка 2 - продукти на метилиране на обикновени липиди.

Стрелкае показана посоката на движение на фронта на разтворителя (системата). По време на хроматографията фронтът на разтворителя се премества към горния ръб на плаката.

Приложение на метода ТСХ във фармацията

Голямото значение на хроматографските методи за фармацията се дължи на факта, че при производството на лекарства в много случаи се изисква предварително изолиране на природни или синтетични продукти в техния чист вид. Анализите също често се основават на разделяне на смеси на компоненти. Нека да разгледаме два примера за използването на метода TLC, доказващи значението му при анализа и производството на лекарствени вещества.

КОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ТРИТЕРПЕНОВИ САПОНИНИ ЧРЕЗ HPTLC С ИЗПОЛЗВАНЕ НА СКАНИРАЩА ДЕНСИТОМЕТРИЯ

Тритерпеновите сапонини (гликозиди) са активните съставки на много лекарства.

Повечето от използваните в момента методи за количествено определяне на тритерпенови сапонини се основават на киселинна хидролиза на последните с по-нататъшно определяне на агликона, най-често чрез титриметрични, по-рядко чрез методи за спектрален анализ.

Такива методи, базирани на разрушаването на сапонинови молекули, имат редица недостатъци. Те са дълготрайни и не позволяват количествена оценка на съотношението на отделните сапонини в общите сапонин-съдържащи препарати.

В повечето случаи авторите обикновено се ограничават до качествена оценка, използвайки метода TLC, най-достъпният и прост хроматографски метод за анализ. Използването на TLC за определяне на количественото съдържание на компонентите е затруднено от липсата на сканиращи денситометри.

Тази работа представя резултатите от количественото определяне на TLC на някои тритерпенови сапонини, производни на олеанолова киселина, във фармацевтични продукти и екстракти от растителни материали.

Избрахме тритерпенови сапонини от манджурска аралия (аралозиди) като обект на изследване. качественото определяне на които в различни обекти е обхванато в трудовете, както и тритерпенови сапонини от захарно цвекло - вещества с предварително установена фармакологична активност. И двете са производни на олеанолова киселина с малко (не повече от четири) количество захарни остатъци, което предполага подобно поведение в тънък слой сорбент

Сумата от аралозиди, изолирани от таблетки Saparal, и сумата от сапонини от захарно цвекло, изолирани от прясно събрани коренища, се използват като стандарти. За нанасяне върху плаката се приготвят водно-алкохолни (80% етанол) разтвори на сапонини, съдържащи 0,4 - 2,0 mg/ml. Хроматографията се извършва с помощта на тънкослойна хроматография "Silufol" (Чехия) 15 х 15 cm, "Armsorb" за HPTLC (Армения) 6 х 10 cm и "Sorbfil" (Русия) 10 х 10 cm. Височината на предното издигане, достатъчна за пълно разделяне, беше съответно 10,6 и 6 cm. Пробите се нанасят с помощта на микроспринцовка MSh-10 (Русия) върху плоча, загрята до 40 ° C. Оптималният обем на нанесената проба е 3-5 µl. Прилагането се извършва на няколко етапа, така че диаметърът на изходното място да е не повече от 2 мм.

Хроматографията се провежда при температура 20 - 25 °С. След завършване на елуирането, плаките се изсушават на въздух и се третират с реагент за откриване, като се използва лабораторна стъклена бутилка със спрей. Сканирането на зоните беше извършено с помощта на сканиращ денситометър Shimadzu CS-9000 (Япония) Качеството на зоните, получени чрез хроматография в трите най-често препоръчвани системи за елуиране, беше сравнено: I. хлороформ - метанол - вода (30:17:3): II. n-бутанол - етанол - амоняк (7:2:5); III. n-бутанол - вода - оцетна киселина (4:5:1), горен слой; IV. бензен - етил ацетат (1:1) ( за захарни сапонини цвекло).

Като реактиви за откриване се използва 25% алкохолен разтвор на фосфорноволфрамова киселина (малинени петна от сапонини на бял фон). най-често се използва за количествени TLC определяния на такива съединения и 10% алкохолен разтвор на фосфомолибденова киселина, препоръчван за развитието на тритерпеноидни зони (сапониновите зони са тъмносини на жълт фон). В последния случай третирането на плочите с амонячни пари позволява обезцветяването на фона и увеличаването на контраста на петната.

В резултат на изследването бяха избрани оптимални условия за хроматографския процес за денситометрично определяне. Armsorb за HPTLC беше признат за най-добрият от трите вида плочи. Високата ефективност на процеса се улеснява от тънък (II0 µm) и равномерен по фракционен състав (5-10 µm) слой силикагел, който осигурява добро разделяне и минимална ерозия на зоните дори когато фронтът на разтворителя се повиши с 6 cm. Плаките Sorbfil са почти толкова добри, колкото и тях по отношение на способността за разделяне, но времето за елуиране за тях е почти два пъти по-дълго. Плаките Silufol с достатъчно висока скорост на елуиране позволяват разделянето на компонентите по по-дълъг хроматографски път, което води до известно размиване на зоните, но тяхното използване също е възможно.

Елуирането може да се извърши доста ефективно във всяка от първите три системи за елуиране. I дава печалба във времето, IV позволява да се получи по-добро разделяне на сапонините от захарно цвекло от първите три.

И двата реагента за откриване дават доста стабилно оцветяване на зоните при сканиране в рамките на 1 - 2 часа от момента на проявяване. След този период сапониновите зони на плочи, третирани с фосфоноволфрамова киселина, променят цвета си от пурпурно до виолетово, което може да доведе до изкривяване на резултатите от количествения анализ по време на сканиране. Лечението с фосфомолибденова киселина е по-предпочитано в този случай. Когато се съхраняват на защитено от светлина място, плаките със зони, проявени с този реагент, дават напълно възпроизводими резултати след няколко месеца от момента на проявяване.

Границата на откриване на сапонините е 5 μg в пробата, когато е проявена с фосфоволфрамова киселина и 0,5 μg в пробата, когато е проявена с фосфомолибденова киселина. Третирането с амонячни пари направи възможно намаляването на границата на откриване на сапонини в последния случай до 0,2 μg в пробата.

Количественото определяне на сапонините чрез TLC с използване на сканираща денситометрия се извършва върху плочи Armsorb (скоростта на хроматография в този случай е 2 пъти по-висока) или "Sorbfil", в системите за елуиране II и III (като съдържащи по-малко токсични компоненти). Зоновата детекция се извършва с 10% разтвор на фосфомолибденова киселина. Обемът на приложената проба е не повече от 5 µl, височината на издигане на фронта на елуента е 6 cm, времето за елуиране е 30 - 60 минути. Дължина на вълната на сканиране λ = 675 nm. След обработката на плочите сапонините на аралия и захарно цвекло се появяват под формата на три зони с различна интензивност.

Общ изглед на денситограмите, получени по време на сканиране, е представен на фиг. 1.

Сравнение на хроматограми на сапонини, изолирани от таблетки "Сапарал" (фиг. 1, а) и "Тинктура от аралия" (фиг. 1,6) ни позволява да отбележим различни съотношения 44

аралозиди А, В и С, които са част от тези лекарствени форми. Подобно несъответствие в съотношението на отделните сапонини в суровините в зависимост от условията на отглеждане на растението беше отбелязано по-рано. Съотношението на сапонините в готовите дозирани форми може лесно да се оцени с помощта на получените денситограми. Тъй като хроматограмата показва 3 зони, съответстващи на сапонините, а денситограмата има съответно три пика, площите на всички пикове се сумират при конструирането на калибрационната зависимост. Грешката в този случай е по-малка, отколкото при извършване на изчисления въз основа на параметрите на пика на един от компонентите, като се вземе предвид променливостта на тяхното съотношение (фиг. 2).

Ориз. I. Денситограми, получени чрез сканиране на TLC плаки: А- Сапонини от аралия, изолирани от таблетки “Сапарал”; 6 - сапонини от тинктура от аралия; V- сапонини от захарно цвекло. Общото съдържание на сапонини в пробата е 5 μg. А, Б, В- пикове на сапонини; 0 - начална линия; f- Предна линия.

Ориз. 2. Калибрационна зависимост на сумата от площите на пикон сапонините в хроматограмата от тяхното съдържание в пробата. / - сапонини от аралия; 2 - сапонини от захарно цвекло. По абсцисната ос е съдържанието на сапонини в пробата (mcg), по ординатната ос е сумата от пиковите площи (cm2).

Зависимостта на калибрирането на сумата от площите на пиковете върху денситограмата от съдържанието на веществото в пробата се получава чрез хроматография на серия от стандартни разтвори с известно съдържание на сапонин. Първоначалният разтвор се приготвя чрез разтваряне на точно претеглена част от сапонини в 80% етанол, изсушени до постоянно тегло. Серия от работни разтвори се приготвя чрез серийно разреждане на първоначалния разтвор с 80% етанол. Съдържанието на сапонини в тях е 0,04 - 2,0 mg/ml (0,2 - 10 μg в проба с обем на пробата 5 μl). Този диапазон на концентрация може да се счита за оптимален за сканиране. Минималното съдържание на сапонин, определено по този метод, е 0,2 μg/проба. Относителното стандартно отклонение в този случай не надвишава 0,03.

Получените калибрационни зависимости са нелинейни, което е в пълно съответствие с теорията на Kubelka-Munk, която отчита абсорбцията и разсейването на светлината от сорбента. В тесен диапазон от ниски концентрации зависимостите могат да се считат за линейни (0,2 - 2,0 μg/проба). Нелинейната част от кривите може да бъде линеаризирана чрез преобразуване на количеството вещество в пробата и площта на пика в реципрочни количества и приема формата, показана на фиг. 3.

Ориз. 3. Зависимост на реципрочната стойност на сумата от площите на пиковете на сапонините върху хроматограмата (1/S 10 -1) от тяхната реципрочна стойност на съдържанието им в пробата (1/m - 10 -1). 1 -сапонини от аралия; 2 - сапонини от захарно цвекло.

С помощта на получената калибровъчна зависимост се определя съдържанието на сапонини в тинктурата от аралия. 5 ml тинктура се разреждат със 70% етанол в мерителна колба от 25 ml. 5 μl от получения разтвор се нанасят върху началната линия на плочите Armsorb.5 μl стандартен разтвор на аралозиди с концентрация 1 mg/ml (5 μg в пробата) се нанасят върху съседната точка. обработени, както е описано по-горе.

Разликата между получените резултати и резултатите от определянето с помощта на FS 42-1647-93 (5,3 mg/ml) е 6 - 7% в посока на надценяване, което може да се обясни със загубата на сапонини по време на многоетапна предварителна обработка. подготовка на пробата с помощта на FS (таблица).

Описаният по-горе метод беше използван за определяне на сапонини в таблетки Saparal и в растителни суровини (корени от манджурска аралия и коренища от захарно цвекло) с предварителна изчерпателна екстракция на сапонини от таблетките от суровините - 80% горещ етанол. Отклоненията от резултатите от определянето съгласно FS 42-1755 - 81 за таблетки (0,040 g) са в същите граници, както за тинктурата (таблица).

По този начин е демонстрирана възможността за бързо количествено определяне на някои тритерпенови сапонини и производни на олеанолова киселина във фармацевтични продукти и растителни суровини с помощта на метода HPTLC с последваща количествена оценка на получените зони с помощта на сканираща денситометрия.

Резултатите от определянето корелират доста добре с резултатите от определянето чрез FS. Техниката ви позволява да комбинирате определянето на автентичността на лекарствата чрез TLC (чрез FS) с последващо сканиране на зони от компоненти върху плочите и тяхната количествена оценка. Хроматограмите, получени чрез сканиране, също позволяват да се определи съотношението на отделните сапонини в анализираните обекти.

Резултатите от количественото определяне на аралози вCTofik-от аралия (I) и таблетки "Saparal" (2) от THC с помощта на сканиращ dsnsptoietrnn /" = 0,95, и - 5,/=2,78,/=4

ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЛИПИДНИЯ И ФЛАВОНОИДНИЯ СЪСТАВ НА ПРОБИ ОТ НЯКОИ ВИДОВЕ ОТ РОДА ( Lathyrus .)

От много представители на семейство Бобови, като люцерна, лупина, фий, са изолирани флавоноиди с широк спектър на действие: противовъзпалително, ранозаздравяващо, съдоукрепващо и др. От червена детелина са изолирани изофлавони: биоханин А - 0,8% и формононетин - 0,78%, които имат естрогенна активност.

Изследвахме състава на флавоноидите в някои видове от рода: Ch.сеитба (I), Chlugovaya (II), Ch.пролет (III), Ch.гора (IV).

За целите на възможното използване на липидния комплекс в хранителни добавки и лекарства, ние също проучихме пълния фракционен състав на липидите в тревата и семената на брадата.

Материали и методи

Изолирането на липидната фракция от сухи суровини се извършва съгласно метода на Bligh и Dyer.

1,6 ml дестилирана вода се добавя към проба (0,2 g) от сух растителен материал и се държи на студено за 24 часа. След това се добавят 6 ml смес от хлороформ - метанол (1:2) и се оставят за 3 дни, след което се центрофугират при 8 хиляди rpm за 15 минути. 2 ml вода и 2 ml хлороформ се добавят към прозрачния супернатант. Получената двуфазна система се отделя в разделителна фуния. Хлороформният слой се промива два пъти с метанол и се изпарява до сухо на ротационен изпарител. Остатъкът се изсушава във вакуумен ексикатор, след това се разрежда с хлороформ до концентрация 10 mg/ml и разтворът се съхранява в стабилизиран хлороформ при +4°С.

Качественият анализ на липидната фракция се извършва с помощта на метода TLC върху плаки Kieselgel 60 (254) в следните системи разтворители:

А. За неутрални липиди: 1) Хексан - бензен (9:1); 2) Хексан - естер - оцетна киселина (90:10:1).

Б. За полярни липиди (фосфолипиди): 1) хлороформ - ацетон - метанол - оцетна киселина - вода (6:8:2:2:1), кисели; 2) хлороформ - мета-

нол - 26% амоняк (65:25:5), основен; 3) хлороформ - метанол - вода (65:25:4), неутрален.

При определяне на качествения състав на фосфолипидите, тяхната идентификация се извършва с помощта на различни проявители (йодни пари, нинхидрин, реагент на Драгендорф, сярна киселина) и с помощта на R fстандарти.

Горният набор от системи и реагенти позволи цялостен анализ на липидни фракции, изолирани от китайски проби.

За изследване на флавоноидния състав, като се вземат предвид фазите на вегетационния период, бяха избрани следните проби: I (фаза на цъфтеж); IV (фаза на цъфтеж); III (придружител) фаза на пъпкуване; II (фаза на цъфтеж); II (фаза на плододаване); II (вегетационна фаза преди цъфтеж).

Изолирането на флавоноиди от сухи суровини е извършено по метод, който осигурява тяхното изчерпателно извличане.

За тази цел 1 g натрошена билка се поставя в колба с обратен хладник, залива се с 20 ml 70% етанол и се вари 20 минути на водна баня. Екстрактът се охлажда, филтрува се през стъклен филтър на Шот и се изпарява до сухо на ротационен изпарител. Остатъкът се разтваря в етилов алкохол до крайна концентрация от 10 mg/ml. Определянето на общото флавоноидно съдържание се извършва с рутин като стандарт. Резултатите от това изследване са показани в табл. 3.

Определянето на качествения състав на флавоноидите се извършва чрез TLC върху плочи Kieselgel 60(254) от Merck, в система от разтворители n-бутанол - оцетна киселина - вода (6:1:2). Детектор - сярна киселина под UV (254 nm) - петна от люлякови флавоноиди на зелен фон.

маса 1

Общото съдържание на флавоноиди в суровините (трева) от различни видове трева (в%, на базата на абсолютно сухо тегло)

Ориз. 1. ТСХ на флавоноиден състав на отделни видове от род China. C - сума от флавоноидни свидетели: онин - R f 0,28; рутина - Р 0,48; лутеолинов глюкозид - R f 0,58; формононетин - R f 0,64; кверцетин - R f0,79: лутеолин - R f 0,82; биоханин А - R f 0,85; апигенин - R f 0,92.

Ориз. 2. TLC на флавоноиди от ливадна трева в различни фази на вегетационния период. IIa - фаза на цъфтеж; IIb - фаза на плододаване: IIc - фаза на вегетация преди цъфтеж. C - сума от флавоноидни свидетели: онин - R f f 0,28; рутина - R f 0,48; лутеолинов глюкозид - R f 0,58; формононетин - R f 0,64; кверцетин - R f 0,79; лутеолин - Р ( 0,82; биоханин А - R f 0,85; апигенин - R f 0,92.

При изследване на флавоноидния състав на II в различни фази на вегетационния период беше отбелязано, че освен рутин и кверцетин, ононин и формононетин присъстват в забележими количества в екстракта. Останалите флавоноиди се намират в следи.

По този начин е показано, че в различните видове брадичка, в различни фази на вегетация, те съдържат както гликозиди, така и агликони - ононин, рутин, лутеолинов глюкозид и техните агликони: формононетин, кверцетин и лутеолин, като съставът им варира в зависимост от вид растение, и в едно растение (ливадна брадичка) в зависимост от фазата на вегетационния период.

таблица 2

Количественото съдържание на основните флавоноиди в отделни представители на рода (в %, по отношение на абсолютно сухо тегло)

Във II са открити както ононин, така и формононетин във вегетативния период. По време на периода на цъфтеж и плододаване количеството на ононин значително намалява, а количеството на формононетин се увеличава.

Количественото съдържание на основните флавоноиди в изследваните проби е определено чрез количествена ТСХ при същите условия. Резултатите от това изследване са показани в табл. 2.

Както следва от данните в табл. 2, различните видове брадичка са богат източник на блофлавоноиди, поради което тези растения проявяват един от видовете биологична активност.

Заключение:

Една от важните задачи на съвременната химия е надеждният и точен анализ на органични вещества, често подобни по структура и свойства. Без това е невъзможно провеждането на химични, биохимични и медицински изследвания; екологичните методи за анализ на околната среда, криминалистичните експертизи, както и химическата, нефтената, газовата, хранителната, медицинската промишленост и много други сектори на националната икономика до голяма степен се основават на това. Тук са представени само малка част от методите и техниките на тънкослойната хроматография. Но както можете да видите от това малко нещо, тънкослойната хроматография има значителни и сериозни възможности, съчетани с удобство и простота.

Хроматографията в съвременната химия

Една от важните задачи на съвременната химия е надеждният и точен анализ на органични вещества, често подобни по структура и свойства. Без това е невъзможно провеждането на химични, биохимични и медицински изследвания; екологичните методи за анализ на околната среда, криминалистичните експертизи, както и химическата, нефтената, газовата, хранителната, медицинската промишленост и много други сектори на националната икономика до голяма степен се основават на това.

Един от най-чувствителните методи е хроматографският анализ, предложен за първи път от руския учен М. С. Цвет в началото на 20 век. и до края на века се превърна в мощен инструмент, без който както синтетиците, така и химиците, работещи в други области, вече не можеха.

Цветното разделяне се извършва в колоната, показана на фиг. 1. Смес от вещества A, B и C - естествени пигменти, първоначално разположени в зоната д,– се разделя чрез добавяне на подходящия разтворител D (елуент) в отделни зони.

Както винаги, всичко започна, изглежда, с най-простото нещо, което всеки ученик може да направи. В предишни години учениците, включително авторът на тази статия, пишеха с мастило. И ако попивателна подложка падне върху петно ​​от мастило, тогава може да се забележи, че разтворът на мастилото е разделен на няколко „фронта“ върху него. Хроматографията се основава на разпределението на едно от няколко вещества между две, както се казва, фази (например между твърдо вещество и газ, между две течности и т.н.), като една от фазите непрекъснато се движи, т.е. той е мобилен.

Това означава, че такава фаза, например газ или течност, непрекъснато се движи напред, нарушавайки равновесието. Освен това, колкото по-добре се сорбира (абсорбира) или разтваря дадено вещество в неподвижната фаза, толкова по-ниска е скоростта на неговото движение и, обратно, колкото по-малко се сорбира съединението, т.е. има по-малък афинитет към неподвижната фаза, по-голяма скорост на движение. В резултат, както е показано на фиг. 2, ако първоначално имаме смес от съединения, след това постепенно всички те, изтласкани от подвижната фаза, се придвижват към „финала“ с различни скорости и накрая се разделят.

Ориз. 2. Основният принцип на хроматографското разделяне: NF е слой от неподвижна фаза, покриващ вътрешната повърхност на капилярната тръба T, през която протича подвижната фаза (MP). Компонент А 1 от сместа, която трябва да се раздели, има висок афинитет към подвижната фаза, а компонент А 2 към неподвижната фаза. A "1 и A" 2 – позиции на зони на същите компоненти след период от време, през който е настъпило хроматографско разделяне в посоката, посочена със стрелката

На практика проба от смес от вещества се въвежда, например, със спринцовка в слой от неподвижна фаза и след това различните съединения, включени в сместа, заедно с подвижната фаза (елуент), се движат по слоя , водени от тази фаза. Скоростта на движение зависи от големината на взаимодействието (афинитета) на компонентите в неподвижната и подвижната фаза и в резултат на това се постига разделяне на компонентите.

След разделянето всички компоненти трябва да бъдат идентифицирани и количествено определени. Това е общата схема на хроматографията.

Трябва да се отбележи, че този модерен метод дава възможност за няколко минути да се определи съдържанието на десетки и стотици различни съединения в смес, дори и в незначителни, „следи“ количества от ~10–8%.

Нека разгледаме по-подробно хроматографския метод за анализ. Хроматографските системи могат да бъдат разделени според следните принципи:

– агрегатно състояние на подвижната и неподвижната фази;
– геометрични характеристики на системата;
– механизъм на взаимодействие между отделяното вещество и фазите.

Като подвижна фаза се използва газ или течност. Твърдите вещества или течностите се използват като неподвижни или неподвижни фази.

Въз основа на подреждането на фазите хроматографските системи се разделят на две групи: планарни и колонни.

Последните от своя страна се делят на:

– опаковани, пълни с гранулиран твърд материал (малки топчета), служещи или като среда за разделяне, или служещи като носител на неподвижната течна фаза;
– капиляр, чиито вътрешни стени са покрити с филм от неподвижна течност или слой от твърд адсорбент (абсорбер).

Взаимодействието между разделяното вещество и фазите на хроматографската система може да се случи или на повърхността на фазата, или в обема. В първия случай се нарича хроматография адсорбция, във втория – разпространение.

Механизмите на молекулярно разделяне в хроматографските системи най-често се свеждат до следното:

– неподвижната фаза физически абсорбира (сорбира) отделяните вещества;
– неподвижната фаза взаимодейства химически с отделяните вещества;
– неподвижната фаза разтваря веществата, които трябва да се отделят от разтвора, в несмесващ се разтворител;
– неподвижната фаза има пореста структура, която затруднява дифузията на молекулите на веществата, които се разделят в тази фаза.

Хроматографията, започнала с домашно приготвени устройства като лента хартия, потопена в разтворител, сега е представена от много сложни инструментални системи, базирани на съвременни прецизни или прецизни принципи и оборудвани с компютърен софтуер. Достатъчно е да се каже, че една от най-добрите компютърни компании, Hewlett-Packard, също произвежда модерни хроматографи.

Блок-схемата на хроматографския процес е по същество много проста и е показана на фиг. 3. След това, приблизително в тази последователност, ще бъде разгледан принципът на работа на хроматографа.

Основни видове хроматография

Основните видове хроматография включват адсорбционна, йонообменна, течна, хартиена, тънкослойна, гел филтрация и афинитетна хроматография.

Адсорбционна хроматография. В този случай разделянето на веществата се извършва чрез селективна (селективна) адсорбция на вещества върху неподвижната фаза. Такава селективна адсорбция се дължи на афинитета на определено съединение към твърдия адсорбент (стационарна фаза), а това от своя страна се определя от полярните взаимодействия на техните молекули. Следователно хроматография от този тип често се използва при анализа на съединения, чиито свойства се определят от броя и вида на полярните групи. Адсорбционната хроматография включва йонообменна, течна, хартиена, тънкослойна и газова адсорбционна хроматография. Газовата адсорбционна хроматография е описана по-подробно в раздела „Анализ на елуента“.

Йонообменна хроматография.Йонообменните смоли се използват като неподвижна фаза (фиг. 4), както в колони, така и под формата на тънък слой върху плоча или хартия. Разделянето обикновено се извършва във водна среда, така че този метод се използва главно в неорганичната химия, въпреки че се използват и смесени разтворители. Движещата сила за разделянето в този случай е различният афинитет на отделените йони на разтвора към йонообменни центрове с противоположна полярност в неподвижната фаза.

Течна хроматография. В този случай неподвижната фаза е течност. Най-честият случай е адсорбционната версия на течна колонна хроматография. Пример за разделяне на естествени пигменти е показан на фиг. 5.

Ориз. 5. Хроматографско разделяне на естествени пигменти (флавони и изофлавони)

Хартиена хроматография. Като неподвижна фаза се използват ленти или листове хартия (фиг. 6). Разделянето става чрез адсорбционен механизъм, а понякога се извършва в две перпендикулярни посоки.

Тънкослойна хроматография е всяка система, в която неподвижната фаза е тънък слой, по-специално слой от алуминиев оксид (дебелина 2 mm) под формата на паста, нанесен върху стъклена плоча. Пример за такава система и резултатите от разделянето са показани на фиг. 7.

Гел филтрация или молекулярно сито, хроматография. Принципът на разделяне в такива системи е малко по-различен от предишните случаи. Стационарната фаза са материали, обикновено гелове, със строго контролирана порьозност, в резултат на което някои компоненти на сместа, в съответствие с размера и формата на молекулите, могат да проникнат между частиците на гела, докато други не могат. Този тип хроматография най-често се използва за разделяне на съединения с високо молекулно тегло. Един от вариантите за използване на този метод е да се определят молекулните маси на отделените вещества, които често са необходими за химични изследвания (фиг. 8).

Афинитетна хроматография. Този тип хроматография се основава на взаимодействието между вещество, от една страна, способно да реагира с изолираното съединение, и от друга, свързано с твърд носител на неподвижната фаза. Такова вещество има афинитет към изолираното съединение и се нарича афинитетен лиганд.

Този метод се използва най-често в биохимичния анализ. Например, когато биологични антигени, съдържащи протеини, преминават през целулоза, активирана с цианоген бромид, възниква тяхното специфично задържане, както е показано на Схема 1.

При друг метод, за да се прикрепят протеини към хидроксилната група на целулозата, последната първо се третира с 2-амино-4,6-дихлоро- Sim-триазин и след това продуктът от тяхното взаимодействие реагира с аминогрупата на протеина съгласно схема 2:

Разбира се, броят на хроматографските методи не се ограничава до изброените по-горе. Хроматографията често се комбинира с други физикохимични методи, като масспектрометрия, но тази статия има за цел да запознае читателя само с общите принципи на хроматографията. Следователно, по-нататък ще разгледаме обработката на резултатите от хроматографията.

Методи за разработване на хроматограми

Проявлението е процесът на пренасяне на отделените вещества от подвижната фаза. Развитието може да се извърши по три основни начина: челен анализ, изместване и елуиране. Най-широко използваното е елуирането.

Фронтален анализ. Това е най-простият случай, тъй като тук пробата служи като подвижна фаза. Той непрекъснато се добавя към системата, така че са необходими големи обеми проби. Резултатите са показани на фиг. 9.

Образуването на няколко зони се дължи на различния афинитет на различните компоненти към неподвижната фаза. Водещият ръб се нарича преден, откъдето идва и името. Първата зона съдържа само най-малко задържаното вещество А, което се движи най-бързо. Втората зона съдържа вещества А и В. Третата зона е смес от вещества А, В и С. При фронтален анализ се получава само компонент А в течна форма.

Анализ на изместване. В този случай подвижната фаза има по-голям афинитет към неподвижната фаза, отколкото веществото, което се отделя. Малка проба се инжектира в стационарната фаза. Но поради високия си афинитет подвижната фаза измества и прокарва всички компоненти. Той измества най-силно сорбирания компонент В, който от своя страна измества веществото В, което измества най-слабо сорбирания компонент А. За разлика от фронталния анализ, чрез този метод е възможно да се получат всички основни компоненти в индивидуална (течна) форма.

Анализ на елуента. Подвижната фаза за преместване на разтвореното вещество преминава през хроматографската система. Разделянето се дължи на различния афинитет на компонентите на сместа към неподвижната фаза и следователно поради различни скорости на тяхното движение. Малък обем проба се въвежда в хроматографската система. В резултат на това зоните с компоненти постепенно ще образуват отделни области, разделени от чист елуент. Поради високата си ефективност на разделяне, методът стана най-широко използваният и до голяма степен измести други опции за разделяне. Следователно по-нататък ще разгледаме теорията и хардуерния дизайн на този метод.

Малко теория. Често е удобно да се мисли за хроматографски процеси като за поредица от процеси на екстракция и вещества с много сходни свойства могат да бъдат разделени, тъй като стотици или дори хиляди цикли на екстракция се случват бързо и едновременно по време на хроматографските процеси.

За да се оцени ефективността на хроматографските процеси, въз основа на теоретичната концепция за дестилация (по аналогия с отделянето на масло в дестилационни колони, където теоретичната плоча съответства на частта от дестилационната колона, в която парите и течността са в равновесие), концепция "височина, еквивалентна на теоретична плоча"(VETT). Следователно хроматографската колона се разглежда като набор от хипотетични слоеве (плаки). Под HETT обикновено разбираме дебелината на слоя, която е необходима, за да може сместа, идваща от предишния слой, да влезе в равновесие със средната концентрация на веществото в подвижната фаза на този слой. Може да се опише със следната формула:

ЗАЛОЖЕНИЕ = Л/н,

Където Л– дължина на колоната, н– брой теоретични табели.

HETT е обобщена характеристика на разделянето на веществата. Въпреки това, разделянето на компонентите на сместа е важно, но не е достатъчно. Необходимо е да се идентифицира всеки компонент и да се определи количеството му в пробата. Обикновено това става чрез обработка на хроматограми - зависимостта на интензитета на сигнала, пропорционален на концентрацията на веществото, от времето на разделяне. Някои примери за хроматограми са показани на фиг. 10, 11.

Нарича се времето от момента на въвеждане на пробата в колоната до записването на пиковия максимум време на задържане (tR). При оптимални условия не зависи от количеството въведена проба и, като се вземат предвид геометричните параметри на колоната, се определя от структурата на конкретно съединение, т.е. това е качествена характеристика на компонентите. Количественото съдържание на даден компонент се характеризира с размера на пика или по-скоро с неговата площ. Броя пикова площобикновено се извършва автоматично с помощта на интегриращ инструмент, който записва както времето на задържане, така и площта на пика. Съвременното оборудване ви позволява незабавно да получите компютърна разпечатка, показваща съдържанието на всички компоненти на сместа, която се разделя.

Работата на хроматографа. Схемата за инсталиране на най-простия газов хроматограф е показана на фиг. 12. Състои се от газов цилиндър, съдържащ подвижна инертна фаза (газ носител), най-често хелий, азот, аргон и др. С помощта на редуктор, който намалява налягането на газа до необходимото ниво, газът носител влиза в колоната, която е тръба, пълна със сорбент или друг хроматографски материал, действащ като неподвижна фаза.

Ориз. 12. Схема на работа на газов хроматограф:
1 – цилиндър с високо налягане с газ носител; 2 – стабилизатор на потока; 3 и 3 " – манометри; 4 – хроматографска колона; 5 – устройство за инжектиране на проба; 6 – термостат; 7 – детектор; 8 – записващо устройство; 9 – разходомер

Хроматографската колона е „сърцето“ на хроматографа, тъй като в нея се извършва разделянето на смесите. Високоговорителите са най-често изработени от стъкло; Има стоманени, тефлонови и капилярни колони. В близост до входа на газа в колоната е монтирано устройство за въвеждане на проба. Най-често пробата се прилага с помощта на спринцовка, пробиваща гумената мембрана. Анализираната смес се сепарира в колона и постъпва в детектор - устройство, което преобразува резултатите от сепарирането в удобен за запис вид.

Един от най-използваните детектори е катарометърът, чийто принцип на действие се основава на измерване на топлинния капацитет на различни тела.

На фиг. Фигура 13 показва диаграма на катарометъра. В цилиндрична кухина е поставена метална спирала (съпротивителна нишка), която се нагрява в резултат на преминаването през нея на постоянен електрически ток. Когато газът носител преминава през нея с постоянна скорост, температурата на спиралата остава постоянна. Но ако съставът на газа се промени, когато се появи елуиращото вещество, тогава температурата на спиралата се променя, което се записва от устройството.

Друг често срещан детектор е пламъчно-йонизационен детектор, чиято диаграма е показана на фиг. 14. Той е много по-чувствителен от катарометъра, но изисква подаване не само на газ-носител, но и на водород. Газът носител, излизащ от колоната, съдържаща елуента, се смесва с водород и преминава в дюзата на горелката на детектора. Пламъкът йонизира молекулите на елуента, в резултат на което електрическото съпротивление между електродите намалява и токът се увеличава.

Течната хроматография използва спектрофотометрични детектори (във видимата, UV и IR области), както и рефрактометрични детектори, базирани на измерване на индексите на пречупване на разтвори.

Това са, в общи линии, основите на хроматографския анализ. Разбира се, статията предоставя само общи принципи на хроматографията и често те са просто посочени. Всъщност „кухнята“ на този метод е доста голяма и сложна. Основната цел на тази статия, според автора, е да привлече вниманието на младите читатели към този мощен метод.

Тези, които желаят да се запознаят по-добре с тази област, могат да се обърнат към литературата по-долу.

Литература

Жуховицки А.А., Туркелтауб Н.М. Газова хроматография. М.: Гостоптехиздат, 1962, 240 с.;
Сакодински К.И., Киселев А.В., Йогансен А.В.и др.. Физико-химично приложение на газовата хроматография. М.: Химия, 1973,
254 стр.;
Течна колонна хроматография. В 3 тома Изд. Z. Deila, K. Macieka, J. Janaka. М.: Мир, 1972;
Березкин В.Г., Алишоев В.Р., Немировская И.Б.. Газова хроматография в полимерната химия. М.: Наука, 1972, 287 с.;
Морозов А.А.Хроматография в неорганичния анализ. М.: По-високо. училище, 1972, 233 с.;
Березкин В.Г., Бочков А.С.. Количествена тънкослойна хроматография. М.: Наука, 1980, 183 с.;
Лабораторен наръчник по хроматографски и сродни техники. В 2 т. Изд. О. Микеш. М.: Мир, 1982, т. 1–2, 783 с.;
Хроматографски анализ на околната среда. Изд. Р. Гроба. М.: Мир, 1979, 606 с.;
Кирхнер Ю. Тънкослойна хроматография. В 2 тома М.: Мир, 1981, том 1, 615 с., том 2, 523 с.;
Екстракционна хроматография. Изд. Т. Браун, Г. Герсини. М.: Мир, 1978, 627 с.

В.В.Сафонов,
професор в Москва
държавен текстил
Академия на името на А. Н. Косигина