Упаковка днк в хромосомах. Упаковка ДНК в хромосомах

В клетках или вирусах ДНК, по-видимому, никогда не находится в свободной, вытянутой форме. Она связана с низкомолекулярными катионами - ионами двухвалентных металлов либо с ди- и полиаминами или белками, а возможно, с теми и с другими. Взаимодействие осуществляется с помощью электростатических сил - отрицательно заряженные фосфатные группы частично нейтрализуются положительно заряженными ионами металлов и полиаминами или основными аминокислотными остатками белков. В результате таких взаимодействий происходит конденсация ДНК с уменьшением объема, занимаемого молекулой, иногда в тысячу раз. Кольцевая ДНК Е. coli длиной 1,4 мм заключена в клетку, имеющую форму палочки диаметром 1 мкм и длиной 2 мкм; у эукариотических клеток ядерная ДНК длиной почти 2 м в стадии интерфазы заключена в ядре диаметром менее 10 мкм. Ядерная ДНК в клетках, находящихся в стадии митоза, конденсирована еще больше и в световом микроскопе имеет вид очень компактной структуры.

Упаковка ДНК в ядре

В средней эукариотической клетке общая протяженность геномной ДНК составляет около 2 м, диаметр ее ядра всего ~10-20 мкм. При этом совокупность генов, работающих в данной клетке, должна быть доступна для РНК-полимераз и транскрипционных факторов, а вся ДНК в делящихся клетках должна реплицироваться.

Сегодня известно, что упаковка ДНК в ядре эукариотической клетки осуществляется в несколько этапов. Сначала нить ДНК укладывается в нуклеосомы, при этом ее длина уменьшается в шесть-семь раз. Затем нуклеосомная нить складывается в так называемую 30 нм фибриллу (соленоид или зигзагообразную нить), что обеспечивает дополнительную компактизацию в 40 раз. Далее фибрилла организуется в большие (50 и более тысяч пар нуклеотидов) петли, концы которых закрепляются на белковом скелете ядра (его часто называют ядерным матриксом). На этом этапе линейные размеры ДНК сокращаются в 700 раз. Существуют и следующие уровни компактизации ДНК, информация о которых в настоящее время весьма скудна и противоречива.

Правильная упаковка ДНК с хромосомными белками осуществляется под наблюдением вспомогательных ферментов. Для корректировки упаковки ферменты-помощники используют энергию АТФ. Исследователи из Университета Пенсильвании (США) сумели искусственно воспроизвести сворачивание хромосомы, и, как говорят учёные, решающим фактором оказалась энергия - наличие в реакционной смеси молекул АТФ. Результаты экспериментов опубликованы в журнале Science.

Рис. 1. Уровни упаковки ДНК в ядре эукариотической клетки.

Пока речь шла лишь об упаковке одной протяженной молекулы ДНК. В первом приближении таковой можно считать ДНК одной хромосомы. Однако геном эукариотической клетки разделен на несколько хромосом. Например, в клетках плодовой мушки дрозофилы - имеется четыре пары хромосом (в клетках человека их 46). Индивидуальные хромосомы можно увидеть под микроскопом только во время митоза. На остальных фазах клеточного цикла они не видны, и ядро клетки представляется относительно гомогенным. В течение многих лет молекулярных биологов интересовал вопрос, занимают ли отдельные хромосомы ограниченные пространства внутри ядра или же при декомпактизации хромосом ДНК каждой из них распределяется по всему ядру, неизбежно перемешиваясь с ДНК других хромосом. Около 10 лет назад ответ на этот вопрос был найден. Методы молекулярной гибридизации позволили окрашивать в интерфазном ядре индивидуальные хромосомы. Оказалось, что они, вопреки общепринятой в то время точке зрения, занимают внутри ядра ограниченные неперекрывающиеся пространства (названные "хромосомными территориями" и располагаются неслучайным образом: хромосомы, богатые генами, локализуются ближе к центру ядра, а бедные генами - ближе к его периферии. В поддержании специфических позиций хромосомных территорий важную роль играет ядерный матрикс.

Хромосомы эукариот

Хромосомы эукариотических клеток состоят в основном из хроматина - комплекса двухцепочечной ДНК и пяти гистоновых белков, обозначаемых H1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Гистоны могут быть ацетилированы, метилированы, фосфорилированы, роlу(АDР)-рибозилированы, а гистоны Н2А и Н2В - ковалентно связаны с белком, называемым убиквитином. Какова роль воздействия указанных компонентов на структуру и функции гистонов - до конца не выяснено. Гистон H1 млекопитающих состоит из примерно 215 аминокислот; размеры других гистонов варьируют от 100 до 135 аминокислот. Все они содержат необычно большое количество положительно заряженной аминокислоты лизина; Н3 и Н4 отличаются от других тем, что у них достаточно высок уровень положительно заряженной аминокислоты аргинина. Соотношение между Н2А, Н2В, Н3 и Н4, содержащимися в хроматине низших эукариот (дрожжи, плесневые грибы), такое же, как в хроматине млекопитающих.

На электронно-микроскопических фотографиях в зависимости от условий выделения и степени растяжения хроматин выглядит либо как длинное волокно диаметром 10 нм, либо чаще как более вытянутое волокно с утолщениями - «бусинками» диаметром 10 нм, нанизанными по всей длине волокна с определенными интервалами:

Электронные микрофотографии хроматина.
А. Волокно хроматина диаметром 10 нм из почечных клеток CV1 обезьяны.
Б. Хроматин из эритроцитов цыпленка, имеющий вид нити с нанизанными на нее бусинками.

Каждая из этих бусинок представляет собой нуклеосомный кор, на который намотан сегмент хромосомной ДНК длиной 145 пар оснований. Кор - это гистоновый октамер, состоящий из гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, по две молекулы каждого вида:

Модель нуклеосомного кора, построенная по данным кристаллографического анализа низкого и высокого разрешения.
Сегмент ДНК (145 пар оснований), изображенный в виде трубки, обвивает гистоновый октамер, делая вокруг него 1 3 / 4 оборота

Молекула ДНК, обвиваясь 1 3 / 4 раза вокруг нуклеосомного кора, образует сверхспираль.

Пятый гистон, H1, не входит в состав нуклеосомного кора и не участвует в процессе наматывания ДНК на гистоновый октамер. Он контактирует с ДНК в тех местах, где двойная спираль входит и выходит из нуклеосомного кора:

Гистон Н1 «сшивает» ДНК в местах, где она начинает и прекращает наматываться на нуклеосомный кор

В такой структуре с одним гистоновым октамером и молекулой гистона H1 ассоциированы 168 пар оснований спиральной ДНК. Как мы уже отмечали, на электронно-микроскопических фотографиях хроматин часто обнаруживается в двух альтернативных формах: в форме волокна с четко разделенными нуклеосомами (нуклеосомы имеют вид бусинок, нанизанных на нитку) или в форме волокна диаметром 10 нм, в котором нуклеосомы упакованы бок о бок по всей его длине. Волокно диаметром 10 нм может подвергаться дальнейшей конденсации с образованием структур более высокого порядка. При этом нуклеосомы, по всей видимости, образуют соленоид - структуру диаметром 30 нм:

Структура хроматина с разной степенью конденсации.
В нижней части рисунка представлен хроматин, находящийся в растянутой форме; он имеет вид нити с нанизанными на нее бусинками.
Далее изображен хроматин в частично конденсированной форме, представляющий собой волокно диаметром 10 нм.
В верхней части рисунка представлен хроматин в наиболее конденсированном состоянии, когда волокно диаметром 10 нм образует соленоид диаметром 30 нм.
Обратите внимание на взаимодействие молекул гистона Н1, связанных с каждой нуклеосомой, которое способствует конденсации волокна диаметром 10 нм в более плотную структуру

В результате взаимодействия ДНК с гистонами сегмент двойной спирали ДНК из 168 пар оснований со средним диаметром 2 нм и длиной 57 нм превращается в спираль диаметром 10 нм и длиной 5 нм. При последующем сжатии этой спирали до волокна диаметром 30 нм степень конденсации увеличивается еще в шесть раз. Таким образом, упаковка дуплекса ДНК с пятью гистонами приводит к 50-кратной конденсации ДНК. Однако даже столь высокая степень конденсации не может объяснить почти 5000-кратное уплотнение ДНК в метафазной хромосоме.

Эукариотический хроматин содержит и другие белки, которые обычно называют негистоновыми. Некоторые из них, например ферменты, необходимые для репликации и экспрессии ДНК, могут связываться с хроматином временно. Белки, принимающие участие в различных процессах регуляции, связываются с ДНК только в специфических тканях или на определенных стадиях дифференциации.

Сегодня пришли новые технологии и методы, благодаря чему микроскопия в биологии стала трехмерной. Появилась возможность рассмотреть хромосому в интерфазном ядре и получить информацию о локализации в нем сразу всех хромосом человека. Для этого широко применяют гибридизацию in situ (FISH) ДНК индивидуальных хромосом, меченной флуоресцентными красителями, с ДНК интерфазного ядра. Затем с помощью лазерного сканирующего микроскопа получают серию оптических срезов ядра, на которых зарегистрированы интересующие исследователя сигналы. Такие оптические срезы можно рассматривать отдельно, использовать для создания ортогональных проекций или для реконструкции трехмерной организации клеточного ядра.

Хромосомы прокариот

Насколько известно, в упаковке прокариотической геномной ДНК участвуют только два или три белка. О природе взаимодействия этих белков с ДНК и о структуре конденсированного комплекса белокнуклеиновая кислота известно немного. У Е. coli, по-видимому, существует лишь один белок или один класс ДНК-связывающих белков, называемых HU-белками; по своему размеру, содержанию лизина и аргинина, антигенным свойствам они сходны с эукариотическим гистоном Н2А. Другой белок, белок II, обнаруженный у Е. coli и цианобактерий, по повышенному содержанию лизина и ДНК-связывающим свойствам также напоминает эукариотический гистон. Белки HU и II обнаружены в количествах, достаточных для образования комплекса по крайней мере с половиной ДНК Е. coli и, по-видимому, совместно с полиаминами и еще неизвестными нам белками могут осуществлять те же самые функции при конденсации и упаковке ДНК, что и пять эукариотических гистонов.

Митоз

Митоз, или непрямое деление, - основной способ размножения эукариотических клеток, обусловливающий, в частности, возможность увеличения их биомассы, рост и регенерацию. Митоз состоит из четырех фаз.

Первая – профаза – характеризуется началом цикла компактизации хромосом, который продолжается в течение всей этой фазы. Вследствие этого хромосомы становятся видимыми под микроскопом, причем уже в средней профазе митоза они представляются двойными структурами – сестринскими хроматидами, которые являются таковыми, пока удерживаются центромерой вместе. К концу профазы исчезают ядрышко и ядерная мембрана.

Вторая –метафаза. Процесс компактизации хромосом продолжается и ведет к еще большему укорочению их длины. Хромосомы выстраиваются по экватору клетки. Хроматиды соединены между собой между собой в центромере, называемой также первичной перетяжкой. Появляются нити митотического веретена, которые присоединяются к ценромерам. Каждая ценромера испытывает напряжение, поскольку нити веретена тянут ее к противоположным полюсам.

Полюса клетки формируются специальными органеллами – центросомами.

Третья – анафаза – начинается с разрыва ценромеры, в результате чего сестринские хроматиды расходятся к разным полюсам клетки. С этого момента каждая пара сестринских хроматид получает название дочерних хромосом.

Четвертая – телофаза. Хромосомы достигают полюсов клетки, появляются ядерная мембрана, ядрышко. Происходят декомпактизация хромосом и восстановление структуры интерфазного ядра. Заканчивается митоз делением цитоплазмы и в типичных случаях – восстановлением исходной биомассы дочерних клеток.

Биологическая роль митоза состоит в обеспечении идентичной генетической информацией двух дочерних клеток. Это достижимо только благодаря циклу компактизации – декомпактизации, который и позволяет распределить наследственные молекулы в минимальном объеме митотических хромосом. В противном случае, учитывая размеры клетки (десятки или сотни кубических микрометров) и длину декомпактизованной хромосомы (сантиметры), каждое клеточное деление сопровождалось бы хаотичным переплетением хромосомного материала.

В эволюции эукариотических клеток, видимо, это обстоятельство и послужило причиной становления столь сложного генетического процесса, как митоз.

Каждая хромосома индивидуальна, т.е. характеризуется свойственными только ей размерами, формой и положением центромеры. В клетках тела организмов, размножающихся половым путём, любая хромосома представлена двумя копиями, или гомологами. При образовании половых клеток в мейозе в каждую из них попадает одна из двух гомологичных хромосом. При оплодотворении парность гомологичных хромосом восстанавливается: одна хромосома каждой пары отцовская, другая – материнская.
Совокупность признаков хромосомного набора (число хромосом, их размер и форма) постоянна для клеток каждого вида и называется его кариотипом . В кариотипе различают пару определяющих пол организма половых хромосом и все остальные хромосомы – аутосомы. Изучением поведения хромосом в митозе и мейозе, а также роли хромосом, особенно половых, при передаче признаков от одного поколения к другому привело к созданию в нач. 20 в. хромосомной теории наследственности и до настоящего времени исследуется огромным количеством как цитогенетиков, так и других ученых, включая и физиков . Как уже было сказано, хромосомой часто называют генетический материал бактерий и вирусов, хотя его строение отличается от хромосом эукариотических организмов.

Хромосомы - структуры клетки, хранящие и передающие наследственную информацию. Хромосома состоит из ДНК и белка. Комплекс белков, связанных с ДНК, образует хроматин. Белки играют важную роль в упаковке молекул ДНК в ядре.

ДНК в хромосомах упакована таким образом, что умещается в ядре, диаметр которого обычно не превышает 5 мкм (5-10 - 4 см). Упаковка ДНК приобретает вид петельной структуры, похожей на хромосомы типаламповых щеток амфибий или политенных хромосом насекомых. Петли поддерживаются с помощью белков, которые узнают определенные последовательности нуклеотидов и сближают их. Строение хромосомы лучше всего видно в метафазе митоза.

Хромосома представляет собой палочковидную структуру и состоит из двух сестринских хроматид, которые удерживаются центромерой в области первичной перетяжки. Каждая хроматид а построена из хроматиновых петель. Хроматин не реплицируется. Реплицируется только ДНК.

Первый уровень компактизации ДНК - нуклеосомный . Если подвергнуть действию нуклеазы хроматин, то он и ДНК, подвергаются распаду на регулярно повто­ряющиеся структуры. После нуклеазной обработки из хроматина путем центрифугирования вы­деляют фракцию частиц со скоростью седиментации 11S. Частицы 11S содержат ДНК около 200 нуклеотидных пар и восемь гистонов. Такая сложная нуклеопротеидная частица получила названиеНуклеосомы . В ней гистоны образуют белковую основу-сердцевину, по поверхности которой располага­ется ДНК. ДНК образуют участок, с белками сердце­вины не связанный, - Линкер , Который, соединяя две соседние нуклеосомы, переходит в ДНК следующей нуклеосомы. Они образуют «бусины», глобулярные образования около 10 нм, сидящие друг за другом на вытянутых молекулах ДНК. Второй уровень компактизации-30 нм фибрилла. П Ервый, нуклеосомный, уровень компакти­зации хроматина играет регуляторную и структурную роль, обеспечивая плотность упаковки ДНК в 6-7 раз. В митотических хромосомах и в интерфазных ядрах выявляются фибриллы хроматина с диаметром 25-30 нм. Выделяют соленоидный тип укладки нуклеосом: нить плотно упако­ванных нуклеосом диаметром 10 нм образует витки с шагом спирали около 10 нм. На один виток такой су­перспирали приходится 6-7 нуклеосом. В результате такой упаковки возникает фиб­рилла спирального типа с цент­ральной полостью. Хроматин в составе ядер имеет 25-нм фибриллы, которая состоит из сближенных глобул того же размера -Нуклеомеров . Эти нуклеомеры называют сверхбусинами («супербиды»). Основная фибрилла хроматина диаметром 25 нм представляет собой линейное чередование нуклеомеров вдоль компактизованной молекулы ДНК. В составе нуклеомера образуются два витка нуклеосомной фибриллы, по 4 нуклеосомы в каждом. Нуклеомерный уровень укладки хроматина обеспечивает 40-кратное уплотнение ДНК. Нуклесомный и нуклеомерный (супербидный) уровни компак­тизации ДНК хроматина осуществляются за счет гистоновых белков. Петлевые домены ДНК -третий уровень структурной организации хроматина . В высших уровнях организации хроматина специфические белки свя­зываются с особыми участками ДНК, которая в местах связы­вания образует большие петли, или домены. В некоторых местах есть сгустки конденсированного хроматина, розетковидные образования, состоящие из многих пе­тель 30 нм-фибрилл, соединяющихся в плотном центре. Средний раз­мер розеток достига­ет 100-150 нм. Розетки фиб­рилл хроматина-Хромомеры . Каждый хромомер состоит из нескольких содержащих нуклеосомы петель, которые связаны в одном центре. Хромо­меры связаны друг с другом участками нуклеосомного хро­матина. Такая петельно-доменная структура хроматина обеспечивает структурную компактизацию хроматина и организует функ­циональные единицы хромосом - репликоны и транскрибиру­емые гены.

Длина ДНК диплоидного набора хромосом человека составляет примерно 174 см., средняя длина ДНК одной хромосомы – 5 см. В ядре длина одной хромосомы составляет 0,5 – 1 микрон. Такая упаковка двойной спирали ДНК объясняется ее дальнейшей последовательной компактизацией.

Рис. 12. A-, B-, C- и D-формы ДНК

(А. С. Коничев, Г. А. Севастьянова, 2005, с. 90)

1. Нуклеосомный уровень. Нуклеосома - это ДНК - гистоновый комплекс, который выглядит как частица дисковидной формы диаметром 11 нм. Впервые нуклеосомы были описаны в 1974г. А. Олинс и Д. Олинс . Каждая нуклеосома состоит из белкового кора или октамера и 2 оборотов фрагмента двухцепочечной ДНК (рис.13).

Рис. 13. Модель нуклеосомного кора. Сегмент ДНК (146 пар оснований), обвивает белковый кор, делая вокруг него примерно 2 оборота (1¾). (С. Б. Бокуть и др., 2005, с. 52)

Белковый кор (сердцевина) содержит набор из 4 пар гистоновых белковН2А, Н2В, Н3, Н4. Это самые консервативные белки в любом геноме. Они практически одинаковы у гороха и у человека.

Нуклеосомы связываются участками ДНК (линкерная ДНК) свободными от контакта с белковым кором.

Укладка линкерного участка ДНК (60-80 п.н.) и соединение нуклеосом друг с другом идут с помощью гистона Н1. Молекула этого белка имеет центральную (глобулярную) часть и вытянутые «плечи». Центральная часть прикрепляется к специфическому участку на поверхности кора, вытянутые «плечи» соединяют соседние нуклеосомы. При этом ДНК наматывается на соседние коры ка­ждый paз в противоположном направлении (рис. 14).

Выделить нуклеосомы можно непродолжительной обработкой хромосом ферментами дезоксирибонуклеазами. При этом расщепляются участки состыковки нуклеосом. В геноме человека содержатся 1,5 х 10 7 нуклеосом.

Нуклеосомный уровень повышает плотность упаковки ДНК в 7-10 раз. (Рис. 14, 20)

Рис.14. Модель нуклеосомной фибриллы.

2. Нуклеомерный уровень . Дальнейшая компактизация ДНК в составе хроматина свя­зана с образованием нуклеосомных комплексов (рис. 15, 20).Образуется компактная хроматиновая фибрилла построенная либо по типу соленоида (спиральный тип укладки), либо по нуклеомерному типу (4-12 нуклеосом образуют глобулу).

Нуклеомерная укладка хроматина способствует укорочению нити ДНК примерно в 6 раз, а оба уровня приводят к компактизации ДНК в среднем в 50 раз (42-60).

3. Хромомерный уровень.

Следующий этап компактизации ДНК связан с образованием петлеобразных структур, которые называются хромомерами (рис.16). При этом возможны два пути упаковки ДНК с помощью негистоновых белков:

Рис. 16. Хромомерный тип укладки хромосом.

Нить нуклеосом разбита на участки по 20 - 80 тысяч пар азотистых оснований (в среднем – 50 тысяч). В местах разбивки находятся молекулы – глобулы - негистоновых хромосомных белков. ДНК - связывающие белки узнают глобулы негистоновых белков и сближают их. Образуется устье петли. Средняя длина петли (300-400 нм) сходна у различных организмов (дрозофила и человек) и включает примерно 50 тысяч оснований. Такую петельную структуру называют интерфазной хромонемой.

Хроматин типа «ламповых щеток» - это интерфазный эухроматин (рис.17.). Считают, что петли имеют связи с белками хромосомного каркаса, ядерного матрикса и белками ламины.

Рис. 17. Фрагменты хромосом типа «ламповых щеток» из ядра ооцита тритона.

Можно видеть участки ДНК, образующие петли от центральной оси. (С. Гильберт, 1993, т. 2, с. 186)

Укорочение фибриллы на этом уровне происходит в среднем 25 раз, а на всех 3 уровнях в 1000-1500 раз.

4. Хромонемный уровень . При делении клеток идет дальнейшая компактизация хро­мосом - образование более крупных петель из хромомерной фибриллы. На поверхности упакованные молекулы ДНК несут множество белков, которые образуют подобие чехла. Ес­ли удалить этот чехол, то под электронным микроскопом можно отчетливо увидеть, что каждая хроматида построена из хроматиновых петель, отходящих от центральной оси. Диа­метр такой упаковки 700 нм (рис. 18).

Рис.18. Хромонемный тип укладки хромосом.

5. Хромосомный уровень . Даль­нейшая компактизация хромосом обеспечивается петельной укладкой хромонемной нити (рис.19.), что сокращает их длину примерно в 10 раз.

Рис.19. Хромосомный тип укладки.

На этом этапе происходит объединение петель имеющих одинаковую организацию, образуются блоки или минидиски. В образовании одного минидиска участвуют примерно около 20 петель. Таким образом, за счет нескольких уровней компактизации длина ДНК сокращается примерно в 10000 раз. Конденсация хромосом из деконденсированного состояния - это не спирализация , а очень сложный комплекс компактизации , связанный не только с изменением их линей­ных размеров , но и с регуляцией их работы в процессе жизне­деятельности клетки. (Рис. 20)

Кроме того, компактизация хромосомы - важнейший процесс, связанный с точной передачей наследственной ин­формации очередному поколению.

© Разин С.В.

Пространственная организация ДНК

С.В. Разин

Сергей Владимирович Разин, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук,
заведующий лабораторией структурно-функциональной организации хромосом в Институте биологии гена РАН,
профессор кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Еще в начале прошлого века благодаря использованию чисто генетических методов выяснилось, что гены линейно расположены на хромосомах. С тех пор большинство исследователей рассматривают геном как цепь последовательно расположенных генов и межгенных участков, включающих различные регуляторные и другие (казалось бы незначимые) последовательности. Такой стереотип мышления отражается, в частности, в том, что расстояния между генами или другими участками ДНК обычно указывают в тысячах нуклеотидных пар, имея в виду расстояния вдоль молекулы ДНК.

Хотя это вполне корректно, но такое представление о линейности генома заключает в себе определенные опасности. Дело в том, что в ядре эукариотической клетки геном упакован чрезвычайно сложно. В результате последовательности ДНК, в том числе и гены, отстоящие друг от друга на десятки или сотни тысяч нуклеотидных пар, а иногда и вообще расположенные в разных хромосомах, в трехмерном пространстве оказываются в непосредственной близости. Это обеспечивает взаимодействие белковых комплексов, связанных с удаленными (если считать вдоль молекулы ДНК) регуляторными элементами. Такие взаимодействия значительно расширяют возможности работы различных регуляторных систем в геноме эукариотической клетки. В последние годы получено несколько принципиально новых наблюдений, существенно повысивших интерес к пространственной организации ДНК в ядре. Мы попытаемся суммировать современные достижения в этой области.

Упаковка ДНК в ядре

В средней эукариотической клетке общая протяженность геномной ДНК составляет около 2 м, диаметр ее ядра всего ~10-20 мкм. При этом совокупность генов, работающих в данной клетке, должна быть доступна для РНК-полимераз и транскрипционных факторов, а вся ДНК в делящихся клетках должна реплицироваться.

Сегодня известно, что упаковка ДНК в ядре эукариотической клетки осуществляется в несколько этапов (рис.1). Сначала нить ДНК укладывается в нуклеосомы, при этом ее длина уменьшается в шесть-семь раз. Затем нуклеосомная нить складывается в так называемую 30 нм фибриллу (соленоид или зигзагообразную нить), что обеспечивает дополнительную компактизацию в 40 раз. Далее фибрилла организуется в большие (50 и более тысяч пар нуклеотидов) петли, концы которых закрепляются на белковом скелете ядра (его часто называют ядерным матриксом). На этом этапе линейные размеры ДНК сокращаются в 700 раз . Существуют и следующие уровни компактизации ДНК, информация о которых в настоящее время весьма скудна и противоречива.

Рис. 1. Уровни упаковки ДНК в ядре эукариотической клетки.

Пока речь шла лишь об упаковке одной протяженной молекулы ДНК. В первом приближении таковой можно считать ДНК одной хромосомы. Однако геном эукариотической клетки разделен на несколько хромосом. Например, в клетках любимого объекта генетиков - плодовой мушки дрозофилы - имеется четыре пары хромосом (в клетках человека их 46). Индивидуальные хромосомы можно увидеть под микроскопом только во время митоза. На остальных фазах клеточного цикла они не видны, и ядро клетки представляется относительно гомогенным. В течение многих лет молекулярных биологов интересовал вопрос, занимают ли отдельные хромосомы ограниченные пространства внутри ядра или же при декомпактизации хромосом ДНК каждой из них распределяется по всему ядру, неизбежно перемешиваясь с ДНК других хромосом.

Рис. 2. Окраска хромосомных территорий.

А - ДНК метафазных хромосом человека. Б - ДНК интерфазного ядра. В - ДНК метафазных хромосом (синий цвет) после гибридизации с хромосом-специфичными пробами, узнающими хромосому 18 (красный цвет) и хромосому 19 (зеленый цвет); показаны два гомолога соответствующей хромосомы. Г - результаты гибридизации ДНК интерфазных ядер с хромосом-специфичными пробами, узнающими хромосомы 18 и 19. Восемь секций ядра сделаны с помощью конфокального микроскопа; синим окрашена вся ядерная ДНК (как на рис.Б).

Около 10 лет назад ответ на этот вопрос был найден. Методы молекулярной гибридизации позволили окрашивать в интерфазном ядре индивидуальные хромосомы (рис.2). Оказалось, что они, вопреки общепринятой в то время точке зрения, занимают внутри ядра ограниченные неперекрывающиеся пространства (названные "хромосомными территориями", рис.3) и располагаются неслучайным образом: хромосомы, богатые генами, локализуются ближе к центру ядра, а бедные генами - ближе к его периферии . В поддержании специфических позиций хромосомных территорий важную роль играет ядерный матрикс.

Рис. 3. Двумерная и трехмерная модели ядра, показывающие расположение хромосомных территорий .

Взаимодействие удаленных регуляторных элементов

Упаковка ДНК в иерархические хроматиновые структуры принципиально важна для физического расстояния между регуляторными последовательностями и их ориентации в пространстве. А эти последовательности всегда служат площадками связывания регуляторных белков. Уже организация ДНК в нуклеосомы может сделать эти площадки недоступными для белковых факторов, либо ориентировать их так, что посаженные на них белковые комплексы в силу чисто стерических причин (например, направленности в противоположные стороны) не смогут взаимодействовать друг с другом. А при формировании фибрилл возможности подавления либо активации тех или иных регуляторных систем возрастают. Однако расположение нуклеосом на ДНК достаточно динамично. Обратимые изменения в их структуре и степени конденсации хроматина (в частности, переход от развернутой нуклеосомной нити к 30 нм фибрилле и более компактным гетерохроматиновым структурам) составляют наиболее изученную часть эпигенетических механизмов.

Эти механизмы мы не будем обсуждать, а остановимся на следующем уровне упаковки ДНК в хроматине, а именно на протяженных петлях ДНК (рис.1). Их можно увидеть при электронной микроскопии метафазных хромосом и интерфазных ядер, из которых были удалены гистоны. Наличие в интерфазных ядрах топологически замкнутых петель ДНК продемонстрировано и с помощью биохимических методов .

Прикрепленные к ядерному матриксу петли ДНК заинтересовали специалистов прежде всего потому, что по своим размерам они могли бы соответствовать функциональным единицам генома. Для проверки этого предположения требовалось изучить специфичность организации ДНК в петли. Во-первых, установить, одинаково ли разделение генома на петли во всех клетках. Если это предположение верно, то одни фрагменты генома всегда должны находиться в основаниях петель ДНК, а другие - в самих петлях. Во-вторых, выяснить, имеются ли некие особые последовательности ДНК, ответственные за "заякоривание" петель на белковом матриксе ядра.

Метод разрезания генома

За последние 30 лет предложено несколько методов картирования участков прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу (хромосомному остову). Хотя эти методы различаются в деталях, их можно разделить на две принципиально различающиеся группы. Первая основана на выделении так называемой "прилежащей к ядерному матриксу ДНК" (т.е. находящейся в основаниях петель) и фракции петель ДНК, которая отщепляется от ядерного матрикса при ограниченной обработке ядер ферментом нуклеазой (рис.4). Предпочтительное присутствие исследуемого фрагмента ДНК в прилежащей ядерному матриксу фракции, полученной после достаточно интенсивной нуклеазной обработки, позволяет говорить о том, что он прикреплен к ядерному матриксу. Вторая группа методов направлена на изучение специфичности последовательностей ДНК, взаимодействующих с ядерным матриксом. В основе всех методов лежит избирательное связывание in vitro (т.е. в пробирке) фрагментов клонированной ДНК с изолированным ядерным матриксом. Однако результаты, полученные с помощью двух методических подходов, оказались достаточно противоречивыми .

Рис. 4. Схема установления позиций генов в петлях ДНК.

А - нуклеоид, полученный после экстракции гистонов из ядер, не обработанных нуклеазой; одна из петель ДНК содержит три гена: "a" находится в проксимальной (по отношению к ядерному матриксу) части петли, "b" занимает промежуточное положение, и "c" - в дистальной части;

Б - после обработки ядер нуклеазой образуются примерно два разрыва на петлю; фрагменты ДНК, находящиеся в основаниях петель (внутри пунктирного круга), прикреплены к ядерному матриксу. После дифференциального центрифугирования фрагменты разделяются, и в прикрепленной к ядерному матриксу ДНК остаются гены "a" и "b";

В - после дополнительной обработки нуклеазой остается только ген "а".

Мы обратили внимание, что все методы направлены на идентификацию и характеристику фрагментов ДНК, локализованных в основаниях петель. В основе нашего принципиально нового подхода лежит разрезание всего генома на петли и последующая их характеристика. На первый взгляд, разделить геном на индивидуальные петли чрезвычайно трудно. Здесь очень важно, с помощью какого инструмента делать разрывы в основаниях петель ДНК. По счастью, таким инструментом нас обеспечила сама природа. Исследования показали, что один из главных компонентов ядерного матрикса - фермент ДНК-топоизомераза II, регулирующий топологию ДНК. Этот фермент вносит двунитевые разрывы в ДНК, которые после снятия топологических напряжений либо разделения катенанов зашиваются (лигируются) тем же ферментом. На протяжении всей реакции фермент, состоящий из двух субъединиц, остается связанным с ДНК.

Существует целый ряд ингибиторов ДНК-топоизомеразы II (в нашем случае VM-26), которые останавливают реакцию на стадии промежуточного комплекса фермент-ДНК. (Интересно, что большинство из них используются в качестве противоопухолевых агентов.) При этом каждая из субъединиц фермента остается ковалентно связанной с 5ў -концом разорванной цепи ДНК. Если такие блокированные комплексы обработать денатурирующим агентом, после чего разрушить фермент, то получится препарат ДНК, разрезанный на фрагменты в местах контакта ДНК с ферментом (рис.5). Если бы топоизомераза II находилась только в ядерном матриксе, то простая обработка живых клеток ее ингибиторами разрезала бы весь геном по участкам прикрепления ДНК к ядерному матриксу. Однако задача осложняется тем, что этот фермент в растворимой форме присутствует в нуклеоплазме и может вносить разрывы в любом месте (если окажется рядом с ДНК в момент обработки клеток ингибитором). Наиболее вероятными точками разрывов будут свободные от нуклеосом участки, наиболее чувствительные к ДНК-нуклеазе (ДНКазе I). Чтобы исключить возможность разрывов вне интересующих нас участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу, мы экстрагировали растворимый фермент, а заодно и гистоны, обрабатывая ядра 2M NaCl (рис.4). Полученные так называемые нуклеоиды обрабатывали ингибиторами ДНК-топоизомеразы II . Так нам удалось разрезать весь геном на отдельные петли и их олигомеры.

Рис. 5. Схема метода картирования петель ДНК:

А - реакция, катализируемая ДНК-топоизомеразой II, и механизм разрезания ДНК при ингибировании сшивающей активности фермента VM-26 и другими "топоизомеразными ядами";

Б - разрезание геномной ДНК на индивидуальные петли. После удаления гистонов развернутые петли ДНК все еще прикреплены к ядерному матриксу (желтые кружки), содержащему ДНК-топоизомеразу II (фиолетовые кружки). Нуклеоиды инкубируют в среде с VM-26, после чего лизируют додецилсульфатом натрия (SDS). В местах прикрепления петель к ядерному матриксу топоизомераза II разрезает ДНК;

В - в петлях ДНК, обработанных рестриктазой Sfi I, появляются разрывы. Фрагмент Sfi I-Sfi I (показан синим цветом) можно идентифицировать с помощью гибридизации с пробой, комплементарной одному из концов полноразмерного рестриктного фрагмента (синяя стрелка). Справа тот же участок генома после дополнительного разрыва, вызванного топоизомеразой II (фиолетовый кружок). Размер укороченного фрагмента равен расстоянию от участка расщепления ДНК-рестриктазой Sfi I до участка расщепления ее топоизомеразой II;

Г - типичная картина результата электрофореза. На всех дорожках виден полноразмерный Sfi I-Sfi I фрагмент ДНК. В дорожках, содержащих ДНК из нуклеоидов, обработанных высокими концентрациями VM-26, появляется дополнительный (Sfi I-Тopo II) фрагмент, который свидетельствует, что внутри изучаемого фрагмента ДНК находится участок прикрепления к ядерному матриксу.

Что делать дальше? Как установить позиции концов петель на физической карте генома? Напомним, что на такой карте показаны реальные расстояния вдоль молекулы ДНК между теми или иными маркерами. Физические карты различных геномов начали создавать задолго до расшифровки геномов человека и ряда других организмов. В качестве маркеров при создании таких карт обычно используются участки расщепления ДНК ферментами рестриктазами. Установить позиции участка прикрепления петли ДНК к ядерному матриксу на физической карте - значит определить расстояние от места прикрепления до места расщепления ДНК той или иной рестриктазой. Для этого можно воспользоваться методом непрямого мечения концов фрагментов ДНК , предложенным около 30 лет назад для картирования позиций участков гиперчувствительности к ДНКазе I.

Принцип этого метода заключается в том, что после внесения в ДНК разрывов тем или иным агентом (в нашем случае - ДНК-топоизомеразой II ядерного матрикса) препарат дополнительно разрезают избранной рестриктазой. После разделения фрагментов с помощью электрофореза и переноса их на нитроцеллюлозный фильтр проводят гибридизацию с пробой, комплементарной концу вырезанного фрагмента, внутри которого может находиться дополнительный разрыв. Если такого разрыва нет, то после гибридизации получится полноразмерный фрагмент. Но если внутри этого фрагмента ДНК была разрезана топоизомеразой II ядерного матрикса или другим ферментом, фрагмент будет более коротким, и длина его равна расстоянию от участка расщепления ДНК рестриктазой до участка расщепления ДНК изучаемым агентом (рис.5). При работе с петлями, вырезанными ДНК-топоизомеразой II, основная трудность заключается в необходимости разделить по размеру очень длинные фрагменты ДНК. Эту проблему можно решить, используя электрофорез в пульсирующем поле, который позволяет разделить фрагменты ДНК с размерами от нескольких тысяч до нескольких миллионов нуклеотидных пар .

Карта организации в петли-домены гена дистрофина человека

Мы с успехом использовали вышеописанный метод для картирования границ петель в ряде областей генома человека и дрозофилы. После этого была поставлена масштабная задача - построить карту организации в петли-домены самого протяженного из известных генов - гена дистрофина человека. В этом гене, расположенном на Х-хромосоме, около 2500 тыс. нуклеотидных пар, а размер его мРНК составляет всего 14 тыс. нуклеотидных пар. Иначе говоря, более 99% от общей протяженности гена занимают некодирующие последовательности (интроны). В гене дистрофина часто происходят различные перестройки, некоторые из которых приводят к тяжелым наследственным заболеваниям - мышечным дистрофиям .

Рис. 6. Карта организации в петли гена дистрофина человека.

Вверху - схема расположения участков и областей прикрепления ДНК к ядерному матриксу (горизонтальные линии, обозначенные номерами 1-8) в границах гена дистрофина. Вертикальные стрелки (латинские буквы A-I) указывают на расположение участков расщепления; горизонтальные - на позиции гибридизационных проб.

Внизу - схема визуализации уникальных фрагментов ДНК на препаратах нуклеоидов. После экстракции из ядер гистонов петли ДНК расправляются и образуют корону вокруг ядерного матрикса (a). Препараты гибридизуют с пробами, содержащими биотин (жирная полоса на схеме б). Такую пробу можно увидеть после окраски антителами, связанными с флуоресцентным красителем (черные кружочки на схеме в).

Карту расщепления гена дистрофина рестриктазой SfiI построили еще до определения полной нуклеотидной последовательности генома человека. Мы картировали позиции участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу относительно точек расщепления ДНК этой рестриктазой и выяснили, что в гене дистрофина имеется по меньшей мере девять петель, разделенных восьмью зонами прикрепления . В некоторых случаях протяженность участков ДНК, разделяющих две соседние петли, сопоставима с длиной самих петель (рис.6, а). Это принципиально новое наблюдение позволило рассматривать зоны прикрепления ДНК к ядерному матриксу как особую часть генома. Любопытно, что именно тут находятся выявленные ранее в гене дистрофина горячие точки рекомбинации . Обнаруженная закономерность оказалась справедливой и для ряда других изученных генов. Еще одно интересное наблюдение (также подтвержденное на других экспериментальных моделях) состоит в том, что в зонах прикрепления петель располагаются участки, с которых начинается репликация ДНК. Это подтверждает сформулированное нами еще 20 лет назад положение о важнейшем принципе организации эукариотической хромосомы - ее построении из структурно-функциональных доменов, соответствующих репликационным единицам .

Петли ДНК под микроскопом

Экспериментальный подход, использованный нами для картировании петель ДНК, основан на ряде логических предпосылок, вытекающих из радиально-петлевой модели строения хромосомы. До недавнего времени не было прямых доказательств того, что петли ДНК, картированные с помощью разных методов, именно те, которые можно видеть на цитологических препаратах. Среди множества переплетающихся петель ДНК, наблюдаемых под электронным микроскопом, практически невозможно идентифицировать петлю как фрагмент генома, интересующий исследователя. Однако это возможно при анализе петель с более низким разрешением.

Рис. 7. Микрофотографии результатов гибридизации in situ с препаратами ядерных гало (a) с фрагментом человеческого генома - петли ДНК, картированной в гене дистрофина. Эта петля ограничена областями прикрепления к ядерному матриксу 7 и 8. Гибридизация без конкурентной ДНК (б) и в присутствии избытка немеченной фракции повторяющихся последовательностей человеческой ДНК (в).

Если посмотреть на экстрагированные 2M NaCl ядра в флуоресцентном микроскопе (после окраски ДНК тем или иным флуоресцентным красителем), то можно видеть корону петель ДНК в виде облака, окружающего более ярко окрашенную центральную зону (ядерный матрикс) (рис.7, а и схемы на рис.6). Такие препараты называют ядерными гало (nuclear halos), на которых индивидуальные петли неразличимы. Чтобы увидеть их, надо воспользоваться методом гибридизации in situ (в данном случае препаратов иммобилизованных на стекле ядерных гало) с интересующим фрагментом генома. Проба должна содержать аналоги нуклеотидов (например биотинилированный уридин), которые после гибридизации окрашиваются флуоресцентными красителями, например красным или зеленым. Это позволяет одновременно анализировать распределение ДНК, которую проще всего окрасить DAPI (4’,6-диамидино-2-фенилиндолом) в сиреневый цвет, и распределение пробы после гибридизации, окрашенной в красный или зеленый цвет.

В ходе реализации программы по секвенированию генома человека в разных лабораториях клонировали тысячи протяженных (100-300 тыс. нуклеотидных пар) фрагментов ДНК человека. Большинство клонов систематизировали соответственно позициям клонированных фрагментов ДНК в геноме человека. Существует целый ряд научных центров, в которых можно приобрести интересующий клон. Мы взяли клонированный фрагмент человеческой ДНК, представляющий картированную нами в гене дистрофина петлю ДНК, ограниченную участками прикрепления 7 и 8 (см. рис.6). После гибридизации этого фрагмента с препаратами ядерных гало выявляется множество сигналов, распределенных по всему полю (рис.7, б). Это связано с тем, что в ДНК высших эукариот, в том числе и человека, присутствует множество повторяющихся последовательностей, распределенных по всему геному.

Имеющиеся в нашей пробе повторы гибридизуются со всеми комплементарными последовательностями. Понятно, что результаты такого эксперимента не поддаются интерпретации. К счастью, сигналы от гибридизации повторяющихся последовательностей можно подавить. Для этого мы провели гибридизацию в присутствии избытка немеченой фракции повторяющихся последовательностей ДНК человека и увидели петли ДНК, прикрепленные к ядерному матриксу (рис.7, в). Все они имели одинаковый размер (в пределах погрешности измерений), соответствующий длине фрагмента ДНК, картированного в экспериментах по вырезанию петель ДНК-топоизомеразой II ядерного матрикса .

Значение этого результата выходит за рамки простого подтверждения правильности построенной нами карты доменной организации гена дистрофина. Впервые в мире мы показали, что биохимический метод, основанный на радиальной модели строения хромосомы, действительно позволяет картировать петли ДНК, наблюдаемые на цитологических препаратах. Это подтверждает и радиальную модель строения хромосомы, на основании которой разработан наш метод вырезания петель. Далее, возможность наблюдать одинаковые петли ДНК при анализе ряда препаратов ядерных гало подтверждает тот факт, что ДНК организована в петли статично, т.е. во всех клетках к ядерному матриксу прикреплены одни и те же фрагменты ДНК, а участки между ними образуют петли. Мы поставили эксперимент на активно делящихся клетках. Коль скоро во всех клетках выявлены одинаковые петли ДНК, можно утверждать, что специфическая организация ДНК в петли, разделенные зонами прикрепления, сохраняется в ряду клеточных делений. Это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку позволяет рассматривать такую организацию ДНК как один из эпигенетических механизмов. Действительно, при образовании петель могут фиксироваться позиции различных регуляторных элементов и их мишеней, способствуя их взаимодействию либо, наоборот, исключая его.

Петли ДНК, хромосомные перестройки и эволюция генома

Как мы уже говорили, горячие точки рекомбинации гена дистрофина находятся в сегментах, прикрепленных к ядерному матриксу. Дополнительные исследования показали, что к ядерному матриксу прикреплены и горячие точки рекомбинации, присутствующие в ряде других генов, в частности тех, рекомбинации которых ассоциированы с развитием лейкозов . Трудно поверить, чтобы это было просто случайным совпадением. Скорее всего, именно постоянный контакт ДНК с топоизомеразой служит причиной возникновения "горячих точек" хромосомных перестроек. Топоизомераза II может прямо участвовать в незаконной рекомбинации. Еще более вероятно, что внесенные ею двунитевые разрывы в ДНК при определенных условиях могут стимулировать неточное восстановление этих повреждений.

Известно, что репарация двунитевых разрывов в ДНК высших эукариот нередко приводит к различным рекомбинационным событиям. На возможную роль топоизомеразы II как индуктора хромосомных перестроек указывают многочисленные данные о том, что использование ингибиторов этого фермента в химиотерапии опухолей нередко вызывает вторичные лейкозы . Клетки этих лейкозов характеризуются различными крупномасштабными хромосомными изменениями, наиболее частыми в участках расщепления ДНК-топоизомеразой II . Важно отметить, что участки прикрепления петель на молекуле ДНК располагаются достаточно далеко друг от друга, но внутри ядра они могут оказаться в непосредственной близости. Незаконная рекомбинация между такими участками будет приводить к утрате либо перемещению протяженных участков генома, что, в свою очередь, может быть важным фактором эволюции генома .

Литература

1. Getzenberg R.H., Pienta K.J., Ward W.S., Coffey D.S. // Journal of Cellular Biochemistry. 1991. V.47. P.289-299.

2. Cremer T., Kurz A., Zirbel R., Dietzel S. et al. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1993. V.58. P.777-792.

3. Peterson C.L., Laniel M.A. // Curr. Biol. 2004. V.14. P.R546-551.

4. Razin S., Gromova I.I., Iarovaia O.V. // International Review of Cytology. 1995. V.162B. P.405-448.

5. Razin S.V., Hancock R., Iarovaia O., Westergaard O. et al. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1993. V.58. P.25-35.

6. Nedospasov S.A., Georgiev G.P. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. V.92. P.532-539.

7. Schwartz D.C., Cantor C.R. // Cell. 1984. V.37. P.67-75.

8. Hoffman E.P., Schwartz L. // Mol. Aspects Med. 1991. V.12. P.175-194.

9. Iarovaia O.V., Bystritskiy A., Ravcheev D., Hancock R. et al. // Nucl. Acids. Res. 2004. V.32. P.2079-2086.

10. Razin S.V., Kekelidze M.G., Lukanidin E.M., Scherrer K. et al. // Nucl. Acids Res. 1986. V.14. P.8189-8207.

11. Iarovaia O.V., Shkumatov P., Razin S.V. // J. Cell. Sci. 2004. V.117. P.4583-4590.

12. Super H.J., McCabe N.R., Thirman M.J., Larson R.A. et al. // Blood. 1993. V.82. P.3705-3711.

13. Zhang Y., Strissel P., Strick R., Chen J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V.99. P.3070-3075.

14. Razin S.V. // Crit. Rev. Eukar. Gene Exp. 1999. V.9. P.279-283.

Молекулы ДНК в эукариотических хромосомах очень велики. Длина молекул ДНК, выделенных из клеток дрозофилы, достигает 1,2 см, и принято считать, что каждая эукариотическая хромосома содержит одну-единственную непрерывную молекулу ДНК. Упаковка таких огромных молекул в ядрах клеток является основной функцией гистонов, белков, характерных именно для эукариотических клеток.

Основная структурная единица эукариотической клетки - это нуклеосома (рис. 4.18). Нуклеосома содержит по две молекулы каждого из четырех гистонов, Н2А, Н2В, НЗ и Н4, соединенных в форме октамера. Каждый октамер связан с последовательностью из примерно 200 нуклеотидных пар длиной около 700 А. Точное взаимное расположение

4. Природа генетического материала 117

гистона и ДНК в нуклеосоме неизвестно, но считается, что ДНК каким-то образом наматывается на октамеры гистона. Нуклеосома имеет диаметр около 100 Å, и таким образом ДНК в нуклеосоме должна быть сложена примерно всемеро. Другой гистон, HI, обеспечивает связь между нуклеосомами, последовательность которых образует подобие винта (рис. 4.19). Диаметр этого винта (называемого соленоидом) составляет по одним оценкам около 300 Å, по другим -около 500 Å. Это различие, вероятно, обусловлено тем, что для приготовления электронно-микроскопических препаратов использовали разные методы. Если принять диаметр соленоида равным 300 Å, то упаковка последовательности нуклеосом в форме соленоида дает дополнительное уменьшение линейных размеров структуры в целом еще в 6 раз. В интерфазных хромосомах сам соленоид закручен винтом, образуя при этом полую трубку диаметром около 2000 Å, что дает очередное сокращение линейных размеров содержащей ДНК структуры еще примерно в 18 раз (рис. 4.20).

Переход от интерфазной хромосомы к метафазной хроматиде, вероятно, связан с еще одним аналогичным закручиванием теперь уже трубки диаметром в 2000 Å в винтовую структуру диаметром около 6000 Å (рис. 4.20). Эта общая схема организации ДНК в ядрах клеток игнорирует различия в степени спирализации, которые почти наверняка существуют между теми участками хромосом, которые участвуют в синтезе РНК и репликации ДНК, и теми, которые в этих процессах не участвуют. Кроме того, гетерохроматиновые участки хромосом более компактны, чем эухроматиновые. В любом случае ДНК в ядрах эукариотических клеток образует иерархическую систему спиралей, основной единицей которой является нуклеосома.

Хромосомы прокариотических клеток представляют собой кольцевые молекулы ДНК; у Е. coli длина кольца составляет 10 7 Å, т.е. около 1 мм. Эта огромной длины кольцевая нить помещается в клетке

Рис. 4.20. Пространственные модели интерфазной и метафазной эукариотической хромосомы. А. Схематическое изображение винтовых структур, начиная от двойной спирали Уотсона - Крика диаметром 20 Å ; далее нуклеосома - 100 Å, соленоид - 300 Å, трубка- 2000 Å и, наконец, метафазная хроматида - 6000 Å. Б. Пространственная модель двух последних уровней организации метафазной хроматиды, сделанная из проволоки. Тончайшие белые поперечные линии на проволоке (указаны белой стрелкой) представляют двойную спираль Уотсона -Крика диаметром 20 Å, белая черта указывает диаметр соленоида (300 Å), черная –диаметр трубки (2000 Å). В. Модель метафазной хромосомы в меньшем масштабе, чем на Б (черная черта по-прежнему обозначает 2000 Å). Тончайшие белые линии (слева) означают последовательность нуклеосом диаметром 100 Å, закрученную в соленоид диаметром 300 Å; последние уровни иерархии - трубка диаметром 2000 Å и хроматида - 6000 А. Участок трубки диаметром 2000 А в середине рисунка - это центромера, соединяющая два плеча метацентрической хромосомы.

4. Природа генетического материала 119

длиной лишь 2·10 4 Å при диаметре около 8·10 3 Å. Следовательно, ДНК может существовать в клетке лишь в высокоупорядоченном (конденсированном) состоянии. Хотя в прокариотических клетках нет белков гистонов, в них тем не менее содержатся некоторые белки, образующие комплексы с ДНК. При электронной микроскопии разрушенных определенным образом клеток Е. coli можно видеть, что ДНК собрана в «бусины», по величине очень близкие нуклеосомам эукариот (рис. 4.21). Эти

120 Организация и передача генетического материала

бусины очень лабильны, что указывает на то, что взаимодействие между ДНК и белками в клетках Е. coli много слабее, чем между ДНК и гистонами эукариот. Характер иерархической конденсации хромосомы Е. coli не вполне понятен, но хромосома в целом может быть выделена в виде компактной структуры, называемой нуклеоидом.

Не вся ДНК эукариотических клеток находится в ядрах клеток. Митохондрии и недифференцированные хлоропласты растений, так называемые пластиды, представляют собой самореплицирующиеся органеллы и содержат собственные кольцевые молекулы ДНК. Эти молекулы очень невелики и кодируют ограниченное количество информации, необходимой для осуществления органеллами их функций. Так же как и хромосомы прокариот, они не связаны с гистонами и образуют внутри органелл нуклеоиды.

Напечатать